| 研究課題/領域番号 |
16K08934
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
駒井 浩一郎 神戸大学, 保健学研究科, 准教授 (40304117)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| キーワード | インフラマソーム / PYCARD/ASC / スプライスバリアント / 回帰性リウマチ / IL-1 |
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| 研究実績の概要 |
計画書課題1：PYCARD(ASC)スプライスバリアントの回帰性リウマチ(PR)患者における発現解析
大阪リハビリテーション病院から供与されたPR患者検体末梢血由来のcDNA配列解析を終了した。その結果、すでに見出していたエクソン2欠失以外の異常は認められず、エクソン2にコードされるプロリン-グリシンrichな領域が病態形成に関与している可能性が示唆された。
計画書課題2：PYCARD(ASC)スプライスバリアントの機能解析
予定では平成29-30年度実施項目であるが、一部前倒し実行した。既に単離していたPYCARD(ASC)スプライスバリアントの全長cDNAをTHP-1細胞に強制発現させることに成功し、PMAおよび尿酸塩やフラジェリンによる刺激を行い、PYCARD野生型/エクソン2欠損型発現によるIL-1産生量における差異が認められるか比較検討中である。さらに、PYCARD(ASC)スプライスバリアントを特異的ペプチド配列を設計し、抗体作成を受託会社に依頼した。
計画書課題3：PYCARD(ASC)スプライシング異常機構の解明
予定では平成29-30年度実施項目であるが、一部前倒し実行した。バリアント発現が認められたPR患者由来DNAのPYCARD配列を詳細に解析した結果、いずれも家族発症患者のエクソン1上流に一塩基多型ヘテロ変異を見出した。この部位を含む正常型／変異型DNA断片をpSPL3ベクターに挿入しミニジーンを構築し、HEK293細胞に導入しスプライシング再現実験を実施中である。また健常検体の一部においてもエクソン2欠損型mRNAがヘテロ発現していることを見出した。このことより本スプライスバリアントがPR患者のみならず、やはりインフラマソームが信号介在して生じると考えられるメタボリックシンドロームやアルツハイマー病などの疾患感受性にも関わっている可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の採用は年度途中の平成28年10月であり、年度末まで6ヶ月の短期間であったが、一部前倒しを含む予定課題を遂行できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画書課題1：PYCARD(ASC)スプライスバリアントの回帰性リウマチ(PR)患者における発現解析
PR患者検体におけるPYCARD(ASC)スプライスバリアントの定量PCR法による発現量解析を行う。
計画書課題2：PYCARD(ASC)スプライスバリアントの機能解析
リコンビナントPYCARD(ASC)発現THP-1細胞を用いた機能アッセイを継続して行うほか、PYCARD/ASCmRNA発現型別のPBMCを用いた実験を行う。またバリアント特異的ペプチドを抗原として作成した抗体の性能評価を行い、バリアント特異的検出系の開発を行う。
計画書課題3：PYCARD(ASC)スプライシング異常機構の解明
スプライシング再現実験を継続して行うほか、THP-1細胞を用いた再現系やさらにIL-1を添加した条件でのスプライシング干渉効果などを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度途中の採択であったため、予定項目だった学会出張旅費使用はすでに学会終了していたため支出がなかった。また購入物品の一部に値引きが行われたため、予定通りの支出額とならず、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は新年度の物品購入費に充当しする予定である。
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