| 研究課題/領域番号 |
16K08937
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
武森 信暁 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (40533047)
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| 研究分担者 |
鈴木 哲朗 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00250184)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 質量分析 / 肝炎ウイルス / バイオマーカー |
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| 研究実績の概要 |
血中の肝炎ウイルスタンパク質を高感度かつ高選択的に検出するために、選択反応モニタリング（SRM）を用いたアッセイ法の開発をおこなう。本年度は、B型肝炎ウイルスのHBs抗原を解析の対象として、HBs抗原の各アイソフォーム（LHBs、MHBs、およびSHBs）の発現量比を高精度に計測するためのアッセイ構築をおこなった。培養細胞由来のリコンビナントHBs抗原を解析材料とするトリプシンおよびキモトリプシンを用いたペプチドマッピング解析の結果、全発現量推定用プローブペプチド配列およびLHBs特異的配列に由来するペプチド配列を同定することに成功した。MHBｓ特異的なプローブペプチドは同定できなかったため、Glu-C消化産物を用いた探索をさらに進めている。現在までの解析で明らかになったプローブペプチドに関しては、絶対量計測用の内部標準となる安定同位体標識体を合成後、ナノ流量LC-MSシステムを用いたSRMアッセイを構築した。また、血中微量HBs抗原の高感度検出に向けて、ハイブリッドリニアイオントラップ型質量分析装置による高感度検出手法（MRM3rd法）を導入し、検出感度の向上を現在試みている。血清試料のトリプシン消化産物中に含まれる標的プローブペプチドを効率的に濃縮するためのペプチド抗体カラムは現在作成中である。ペプチド抗体を用いたイムノSRMアッセイの開発に加えて、可溶性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（BAC-PAGE）を用いたHBs抗原の分離濃縮法と固定化トリプシンカラムによる迅速消化法を組み合わせた新規アッセイ法の開発も現在進行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、HBs抗原の絶対量計測のためのLC-SRMアッセイ構築は終了した。BAC-PAGEによる新規消化法の開発も順調に進行している。しかしながら、抗体カラムによるイムノSRMの開発に関しては、ペプチド抗体カラムの性能評価が終了しておらず、今後さらに標準試料や実際の血清試料による検証作業が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
HBs抗原のイムノSRMアッセイ開発を引き続きおこなう。具体的には、（１）既知の変異体および各種遺伝子型を網羅した多重モニタリング法の開発、（２）抗体ペプチドおよびBAC-PAGEを用いた質量分析用前処理法の確立をおこなう。開発したアッセイ法を用いて、HBV陽性血液試料に含まれるHBs抗原の絶対量計測を試みる。血清試料に含まれるpg/mLレベルのHBs抗原の検出を目指す。一度のアッセイに必要な血清の量は1マイクロリットル程度と想定しているが、目的の感度が得られない場合には、血清使用量をさらに増やすことを検討する。また、血中の夾雑物による干渉により、SRMで適切な定量結果が得られない場合には、SRMよりも高選択的な質量分析法であるMRM3rd法を用いて解析を試みる。
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