| 研究課題/領域番号 |
16K08939
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
高橋 伸彦 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (20372279)
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| 研究分担者 |
木村 敦 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (90422005)
家子 正裕 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (50250436)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | エクソソーム / 長鎖非コードRNA / 糖代謝異常 / 臓器特異的病態マーカー |
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| 研究実績の概要 |
本研究は糖代謝異常の臓器特異的病態マーカーとなるエクソソーム内在長鎖非コードRNA（lncRNA）の探索を目的としている。本年度は主に培養細胞におけるインスリン抵抗性（感受性低下）モデルの検証とともに、培養液中に分泌されたエクソソームの最適な抽出方法の検討を行った。１）培養細胞の検討には、骨格筋細胞のモデルとしてマウスC2C12骨格筋細胞を、脂肪細胞のモデルとして3T3-L1脂肪細胞を用いた。これらの細胞に対して、パルミチン酸、細胞透過性セラミドあるいはインスリンの長時間暴露の処置を行い、ウエスタンブロット法によるAktリン酸化を指標としてインスリン作用の低下を検討した。今後行う比較実験のためには骨格筋細胞と脂肪細胞の双方がほぼ同等のインスリン作用低下を示すモデルが必要であり、処置条件の検討を繰り返し行った。２）培養液中に分泌されたエクソソームの抽出に関して、３種類の方法（ポリマー沈殿法、リン脂質アフィニティー法、サイズ排除法）を比較検討した。エクソソームの確認はウエスタンブロット法を用い、CD63蛋白質の発現にて行った。さらに、エクソソームの存在を透過型電子顕微鏡にて確認した。また、エクソソームを含有する溶液よりRNAを抽出し、その収量や質の検討を加えた。これらの検討をもとに、現時点でぼぼベストに近い抽出方法を確立した。３）エクソソームに内在するlncRNAの検討に先んじて、インスリン抵抗性を惹起した細胞における細胞内lncRNAの変化をlncRNA PCR arrayにて検討した。その結果、同様の処置を行っても細胞種が異なる場合、その変化するlncRNAも異なるプロファイルを示すことが示唆された。以上、本年度はこれから行う病態マーカー探索の基盤として重要となる実験条件および手技の確立などの基礎的検討を主に行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
病態モデルの確定や良質なエクソソーム内在RNAの採取は、今後の研究において重要な基盤となるため慎重に検討を重ねている。このため、予定よりもやや時間を要している。一方、当初の計画段階では予定していなかった透過型電子顕微鏡によるエクソソームの確認やRNA収量の検討を加えていたり、先んじて細胞内lncRNAの発現に関する検討も行っていることを踏まえると、全体として研究は着実に進展しているものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画書通りに研究を推進する。良質なサンプルが採取され次第、エクソソーム中のRNAをマイクロアレイ法（Clariom D Array、Affymetrix社、昨年発売されたlncRNAの網羅的解析が可能な次世代マイクロアレイ）にて網羅的に解析し、病態特異的lncRNAの探索へと研究を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度中にマイクロアレイを用いた研究を完了できなかったためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
繰り越し分は次年度行うマイクロアレイを用いた研究によって消費される予定である。
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