LAMP法によるヘルペスウイルス感染症のpoint of care test開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08947
• 研究機関: 藤田医科大学
• 研究代表者: 井平 勝 藤田医科大学, 保健学研究科, 教授 (10290165)
• 研究分担者: 榎本 喜彦 藤田医科大学, 医学研究科, 研究員 (00387713) ; 杉山 博子 藤田医科大学, 医学研究科, 研究員 (10387714) ; 東本 祐紀 藤田医科大学, 医療科学部, 助教 (20569701) ; 吉川 哲史 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80288472)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: LAMP / HHV-6 / VZV / Point of Care testing / RPA

研究実績の概要

LAMP法は、迅速な病原体核酸検出を行う有用な検査法であるが、高感度検出法のためのprimer選択が複雑など解決すべき問題も多い。この問題の解決のためRPA法とLAMP法の融合による解決（R-LAMP）を着想した。R-LAMPによるHHV-6 DNAの検出下限は、熱変性による検出限界とほぼ等しい10コピー/反応であり、プラスミド濃度と濁度の間にも良好な直線関係が示された。本法は、熱変性と比較するとコンタミネーションのリスクを減らすことができる一方、余分に試薬が必要など問題はのこる。今後、まだ臨床検体による検討を必要とする。次に、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）によるVZV DNAの検出を行った。この方法でも10コピー/反応を検出することができ、VZV LAMPよりも高感度であることが分かった。しかし、問題としてNTC（No template control）の濁度上昇が確認された。NTCの濁度上昇は、電気泳動結果からprimerダイマーによるものと確認された。この濁度の増加とDNA増幅とを区別するために、ＥprobeをPSRに利用することにした。Ｅprobeは、近年開発された等温増幅法にも利用可能なprobeである。ＥprobeによるPSRの感度も10コピー/反応であった。しかし、EprobeによるPSRを用いたVZV DNAの検出でもNTCの蛍光強度の増加が確認された。この原因は、primer同士のアニールによって生じる産物中にEprobeとのミスアニールする配列が生じる可能性があったことがOligoanalyzerによる解析で分かった。NTCとPSR産物の区別のため行った融解温度分析で、ピーク蛍光温度には、明らかな差があり両者を区別可能であることも分かった。本研究では、臨床検討のためさらなる研究が必要とされるものの、LAMP法の感度改善法、あらたな等温増幅法を構築した。

研究成果

• [雑誌論文] Chromosomally integrated human herpesvirus 6 in the Japanese population. (2018)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Kawamura Y, Hattori F, Kozawa K, Ihira M, Ohye T, Kurahashi H, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: J Med Virol. 巻: 90(10) ページ: 1636-1642
  • DOI: 10.1002/jmv.25244.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Late-phase human herpesvirus 6B reactivation in hematopoietic stem cell transplant recipients. (2018)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Kawamura Y, Hattori F, Tanaka M, Kudo K, Ihira M, Yatsuya H, Takahashi Y, Kojima S, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: Transpl Infect Dis 巻: 20(4) ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/tid.12916.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monitoring Shedding of Five Genotypes of RotaTeq Vaccine Viruses by Genotype-Specific Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays. (2018)
  • 著者名/発表者名: Higashimoto Y, Ihira M, Miyazaki Y, Kuboshiki A, Yoshinaga S, Hiramatsu H, Suzuki R, Miyata M, Miura H, Komoto S, Yukitake J, Taniguchi K, Kawamura Y, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: J Clin Microbiol. 巻: 56(6) ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1128/JCM.00035-18.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rotavirus Vaccination Can Be Performed Without Viral Dissemination in the Neonatal Intensive Care Unit. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiramatsu H, Suzuki R, Nagatani A, Boda H, Miyata M, Hattori F, Miura H, Sugata K, Yamada S, Komoto S, Taniguchi K, Ihira M, Nishimura N, Ozaki T, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: J Infect Dis. 巻: 217(4) ページ: 589-596
  • DOI: 10.1128/JCM.00035-18.
  • 査読あり
• [学会発表] Breakthrough varicella診断におけるdirect LAMP法の有用性 (2018)
  • 著者名/発表者名: 東本祐紀、河村吉紀、服部文彦、三浦浩樹、西村尚子、尾崎隆男、井平勝、吉川哲史
  • 学会等名: 日本ワクチン学会
• [学会発表] Molecular epidemiological analysis of rotaviruses obtained from rotavirus-associated encephalitis/encephalopathy patients (2018)
  • 著者名/発表者名: M Ihira, Y Kawamura,F hattori, H, Miura, Y. Higashimoto, K. Sugata, S. Komoto, K Taniguchi, T.Yoshikawa
  • 学会等名: ESCV
  • 国際学会
• [学会発表] ロタテックワクチン(RV5)接種後の便中ワクチンウイルス株排泄の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 東本祐紀、井平 勝、三浦浩樹、平松裕、鈴木竜太、河本聡志、谷口孝喜、河村吉紀、吉川哲史第
  • 学会等名: 日本臨床ウイルス学会
• [学会発表] 5歳以下の発熱児におけるEBVCMVHHV-6AHHV-6BHHV-7感染の証明と臨床像解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 服部文彦、三浦浩樹、河村吉紀、菅田健、小澤 慶、井平 勝、吉川哲史
  • 学会等名: 日本臨床ウイルス学会
• [学会発表] 健康なiciHHV-6A姉妹例でのHHV-6Bの重感染の証明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三浦浩樹、服部文彦、河村吉紀、菅田健、小澤 慶、井平 勝、吉川哲史
  • 学会等名: 日本臨床ウイルス学会
• [学会発表] ロタウイルス脳炎・脳症分離株の分子疫学的解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 井平勝、東本祐紀、平松裕、鈴木竜太、三浦浩樹、服部文彦、河村吉紀、菅田健、河本聡志、谷口孝喜、吉川哲史
  • 学会等名: 臨床ウイルス学会