| 研究課題/領域番号 |
16K08998
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
萩原 裕子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (90468207)
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| 研究分担者 |
福島 篤 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (10442716)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 疼痛 / 性差 / 分界条床核 / CRHニューロン / ホルマリンテスト / パッチクランプ |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、これまで我々が明らかにしてきた分界条床核外側部の痛み反応の情動成分における性腺ステロイドホルモンの役割について、CRH(Corticotropin-releasing hormone)ニューロンに焦点をあて、電気生理学的に検討することにある。CRH発現細胞にてVenus由来の強い蛍光を示すCRF-VenusΔNeoマウスを用いて実験を行い、痛み刺激としてホルマリンテストを指標に行った。これまでの我々の研究から性差が認められたホルマリン投与10分後にイソフルラン麻酔下で脳を摘出し、スライス切片を作成しパッチクランプ実験に供した。痛み行動はラットと一致して生食投与群では雌雄ともに痛み行動は示さなかったが、ホルマリン投与により雌雄ともに痛み行動を示し、雌では雄と比較して有意に痛み行動が強かった。ただちにスライス切片を作成してTTX存在下でシナプス入力を遮断し、ビククリン存在下で蛍光顕微鏡を用いてCRHニューロンを同定し、その電気活動をパッチクランプホールセル法で膜電位固定法により-60 mVに電位を固定して、mEPSC(miniature Excitatory Postsynaptic Current)を検討した。出現したmEPSCはCNQX投与により完全に消失することからAMPA受容体を介したグルタミン酸の興奮性入力であることを確認した。同様に、TTX存在下でシナプス入力を遮断し、CNQX存在下で0 mVに電位を固定して、mIPSC(miniature Inhibitory Postsynaptic Current)を検討した。出現したmIPSCはビククリン投与により完全に消失することからGABA受容体を介した抑制性入力であることを確認した。実験の結果、雌マウスにホルマリンを投与した群でのみmEPSCの頻度が有意に増加することが分かった。mIPSCでは雌雄差及びホルマリン投与における変化は認められなかった。現在、性腺ステロイドホルモンを変化させることによる痛み行動とCRHニューロンの変化を電気生理学的に検討中である
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
パッチクランプ法による電気生理学的な手法により、分界条床核外側部のCRH陽性ニューロンの電気生理学的な特徴と痛みの関係を性差の観点から明らかにしている。今回、パッチクランプホールセル法で膜電位固定法によりmEPSC(miniature Excitatory Postsynapti c Current)及びmIPSC(miniature Inhibitory Postsynaptic Current)について検討し、雌マウスにおけるホルマリンを投与した群でのみmEPSCの頻度が有意に増加することが分かった。これは実験計画書通りであり、概ね順調に実験が行われていると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回の研究により、パッチクランプホールセル法を用いた膜電位固定法により、mEPSC(miniature Excitatory Postsynaptic Current)とmIPSC(miniature Inhibitory Postsynaptic Current)について検討した。 その結果、ホルマリン投与の痛み刺激により雌性のmEPSCでのみ発火頻度が増加し、有意な性差がある事が示唆された。今後、その性差が性線ステロイドホルモンによるものかを検討するために、性腺ステロイドホルモンの環境の変化や発達時期による変化による実験を進めていく。最終的に、電気刺激を行い、CRHニューロンのシナプスの可塑性を、AMPA/NMDA比やpaired-pulse、LTPなどで検討し、AAVを用いてCRHニューロンのみを光刺激して痛み行動における分界条床核外側部のCRHニューロンの役割を明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）備品 電気生理システムのインキューベーションシステム（廃液吸引）が老朽化しているのでそれを新品交換する予定であったが、フィルターを交換することにとどめた。
（使用計画）次年度は、引き続き電気生理学的な解析を進めていくために、かなりの消耗品の購入が見込まれるのでそれに使用する予定である。また、本年度購入に至らなかった電気生理システムのインキューベーションシステム（廃液吸引）を新品交換する予定である。
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