| 研究課題/領域番号 |
16K09149
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
神田 靖士 関西医科大学, 医学部, 准教授 (70295799)
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| 研究分担者 |
西山 利正 関西医科大学, 医学部, 教授 (10192254)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 活動性結核 / MPB64 / ラオス / 結核迅速診断法 |
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| 研究実績の概要 |
１．ラオス国での検体の収集
共同研究先であるラオス保健省に依頼をし、カムワン県内の病院においてインフォームドコンセントのもと結核患者（疑いを含めて）の検体を収集した。昨年ラオス保健省に対して申請を行っていた倫理申請書がようやく承認されたため、カムワン県内の病院にて結核患者(疑いを含め)９２人から検体(血清と尿)を採取することが出来た。しかしながら、活動性結核の患者の数が予想以上に少なく、さらなる患者数の取得が必要である。また、治療前、治療中、治療後の数回分のサンプルをそれぞれ取得してもらい、それぞれの段階において反応性がどのように変化するか検討する予定である。
２．リコンビナントタンパクの精製と患者血清との反応性の検討
診断用キットを開発する上で必要な抗原MPB64タンパクを取得するため大腸菌によるリコンビナント抗原の作成を行った。昨年までに可溶化をうまくいかず、不溶性タンパクのまま尿素に溶解し、His-tagを用いて精製を行った。その後、ラオスより取得した検体を用いて患者と健常者の比較検討を行った。喀痰塗抹検査陽性の結核患者より取得した血清を用いてDotBlot法にて評価を行った結果、健常者と比較してその反応性は明らかに強かった。しかしながら、健常者にも弱いながら反応性が認められ、非特異的反応が検出された。そこで、現在１次抗体である血清及び２次抗体の希釈倍率の再検討を行う事で最適化を図っている。
また、新たな抗原の候補として結核菌cDNA libraryから患者血清を用いてスクリーニングを行い、診断キットに最適な抗原を探索する。現在、候補遺伝子のクローニングを行い、発現タンパクの確認とその反応性を患者血清を用いて検討しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ラオス国において遅れていた倫理申請書の承諾がようやく取れ、2017年9月にラオス国カムワン県の保健局に出向き結核患者殻のサンプル採取を正式に依頼し、受け入れられた。その後、ラオスの県病院において92人の結核疑いを含めた患者から血清及び尿を採取し、現地で調達した冷蔵庫に保管している。現在、持ち帰ったサンプルを用いて、血清の希釈倍率並びに抗原量の最適化の検討を行っている。その際、ラオスにて行った結核の遺伝子を検出するGenexpertの解析結果並びに喀痰中の結核菌体数のデータを参照しながら、これらのデータと新規診断法の結果との相関性も検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年より大量に発現、精製したリコンビナント抗原MPB64を取得することができ、このタンパクを抗原としてニトロセルロースにDot-Blot法を用いて患者及び健常者の検体(血清)を用いて反応性の検討を行っている。現在のところ健常者の検体においても非特異的反応が確認され、カットオフポイントの設定の検討を行っている。また、採取した患者の尿を用いて同様の検討を行い、その感度、特異性に関しても検討を重ねていく予定にしている。
また、特異性の問題からMPB64抗原のみでは感度、特異度とも成績の良い診断キットの作製が困難になるか脳性を考慮にいれ、新規候補遺伝子の探索を患者血清とのスクリーニングにより行い、合わせて検討する事を予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述の通りラオス国での倫理申請書の承認手続きが予想以上に長引き、検体の収集が昨年度夏以降となった。このことを受けて予定より研究の遂行が遅れており、来年度にかけて更にサンプルの収集と新規遺伝子の探索に費用を要することが予想される。そのため、差し引きした上で少額ではあるが繰越金が発生した。
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