| 研究課題/領域番号 |
16K09207
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
尾関 宗孝 京都大学, 医学研究科, 助教 (80549618)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | villin / 肝臓 / 転写制御 / リトコール酸 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの研究により、villinプロモーターの転写開始点より上流100bp内はvillin発現に必須であることからこの部分に基本転写部位が存在することが推察され、且つリトコール酸応答エレメントも含まれていることが示唆された。そこで本年はこの部位について詳細に検討を行なった。まずこの100bpの塩基配列を解析したところ、-60bp付近にTATA Box様配列の存在が示唆された。そこで遺伝子の転写開始に必要なTATA Boxを含む最小プロモーターを有するPromega社pGL4.26ルシフェラーゼレポーターアッセイベクターを用いてリトコール酸への応答を観察したところ、リトコール酸による強い抑制が観察された。このことから、HepG2細胞においてリトコール酸はTATA Box様配列を介してvillin発現を抑制していることが示唆された。また、これまでの研究においてHepG2細胞におけるvillin発現調節に核レセプターの関与が示唆されていることから、TATA Boxを介したリトコール酸の遺伝子発現抑制における核レセプターアゴニストの影響を観察したところ、有意な変化は認められなかった。これは前年度におけるsiRNAを用いた核レセプターノックダウンにおいて影響が見られなかった結果と一致するものであった。これらのことから、HepG2細胞におけるvillin発現調節において核レセプターはTATA Box様配列による転写調節とは別の機構として存在しているものと推察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究計画における達成目標は、候補となる転写調節配列の絞り込みであった。昨年度の研究から転写開始点上流100bpに着目して研究を進めたところTATA Box様配列を同定し、コントロールとなるTATA Boxを含む最小プロモーターを用いた解析から、リトコール酸はTATA Boxによる発現調節を抑制することが明らかとなった。このことから、HepG2細胞におけるリトコール酸によるvillin発現抑制はTATA Box様配列を介して制御されていることが示唆され、すなわちTBP(TATA Box-binding protein)が主となる転写因子であると推察された。以上のことから、本研究は概ね計画通りに進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度においてはレポーターアッセイベクターのTATA Box様配列について、部分欠損や変異による転写制御の変化の確認を中心として、ゲルシフトアッセイやCHIPアッセイ等を組み合わせることにより、転写因子TBPの関与を裏付けるデータの取得に注力することとする。一方で研究当初に予想された核レセプターの関与は別のエレメントに依存していると考えられ、その検索も並行して行うものとする。そのためにはTATA Box以外のプロモーターを有するレポーターアッセイ用最小プロモーターベクターを用いて、核レセプター応答部位の特定を進める予定である。Villin発現には5'flanking部分も重要であることが報告されており、必要に応じてスクリーニング範囲を広げることも一考する。
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