| 研究課題/領域番号 |
16K09220
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
島田 亮 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (10376725)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | β-ガラクトシダーゼ / p16 / p21 / cyclin D1 / PCNA |
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| 研究実績の概要 |
脳外傷による脳機能障害のメカニズムの解明は、法医学、病理学の実務上非常に重要である。我々は老化細胞のマーカー「老化関連ベータガラクトシダーゼ」(以下β-gal)を基質 X-gal で染色し、損傷部位直下深部が特異的に染まることを実証した。よってβ-galが脳損傷の診断マーカーとして有用と見込まれる。しかし、脳損傷がなぜβ-galを活性化するかは今までに研究報告がなく、そのメカニズムはわかっていない。我々は細胞老化経路の細胞周期に関する遺伝子の発現を解析し、そのメカニズムを解明したい。
１．動物実験。①マウスの外傷性脳損傷を作製。②切片標本を作製③RNAを抽出。
2．発現解析。①酸性β-gal測定キットを用いてβ-galを染色し、ImageJを用いて半定量解析した。結果、脳損傷マウスでは大脳の損傷側に損傷後4、7、14日目にβ-galの発現が有意に増加した。②免疫組織化学法で、細胞周期のタンパクCyclin D1、PCNA、細胞老化 経路の細胞周期を抑制するタンパクp16、p21の抗体を用いて、脳組織に発現を解析した。結果、損傷後1、4、7、14日目にCyclin D1およびPCNAの発現が、アストロサイト、ニューロンおよびマイクログリアを観察した。損傷後4、7、14日目に細胞が老化した時に発現が増加するp16が損傷群損傷側のアストロサイトに発現した。損傷後1、4、7、14日目に細胞老化を媒介するという機能があるp21が損傷群損傷側のニューロン、マイクログリアに発現した。③Realtime PCRで、脳組織に細胞周期の遺伝子Cyclin D1、PCNA、細胞老化経路の細胞周期を抑制する遺伝子p16、p21のmRNA発現を解析した。結果、損傷後4日目にCyclin D1およびPCNAの発現が有意に増加した。また、p16およびp21の発現は損傷後4、7、14日目に有意に増加した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
動物実験及び発現解析の酸性β-ガラクトシダーゼ測定キットを用いて老化関連ベータガラクトシダーゼを染色し予定通り行った。さらに、ImageJを用いて老化関連ベータガラクトシダーゼ発現を半定量解析したことは予想以上に成果を得られたと判断。
免疫組織化学法で、細胞老化 Pathwayの細胞周期を抑制するタンパクp16、p21の抗体を用いて、脳組織に発現の解析も当初の計画より早く終わった。脳損傷後細胞周期が再活性されると報告があり、2年目で細胞周期のマーカーCyclin D1およびPCNAの抗体を用いて、タンパクの発現解析も行った。さらに、2年目で予定していた二次スクリーニングについて、Reatime PCRを用いて、p16、p21、Cyclin D1およびPCNAのmRNAの発現解析を行った。脳損傷後、まず、脳細胞の細胞周期が活性化され、続いて、老化へ進む可能性が示唆された。おおむね順調に進展していると判断。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、二次スクリーニングの細胞老化 Pathwayの細胞周期に関する遺伝子の発現を解析する。
1.動物実験①マウスの脳損傷を作製。②脳損傷後所定時間に、マウスを深麻酔下、緩衝液を灌流し安楽死させ、RNA抽出のため摘出し、-80℃保存する。
2.mRNAの発現解析。酸性β-ガラクトシダーゼ測定キットで発色した脳のエリアと同じ部分(別の動物)から抽出したRNAを用いてRealtime PCRを行う。Applied Biosystems のキットを用いて、cDNAへ逆転写し、Applied Biosystems StepOnePlusリアルタイムPCRシステムを利用して定量解析を行う。解析する遺伝子は老化細胞Pathwayの遺伝子。
3.細胞老化の可能性について、GemininおよびCDT1を注目し、解析する予定。Gemininの発現が減少すると細胞老化へ誘導するという報告がある。GemininはDNA replication inhibitorで、S期に一度複製が開始されたゲノムの複製開始地点へのライセンス化因子の結合を阻害するライセンス化阻害因子である．その発現は，S/G2/M期では高いが，G1期に入るとユビキチン依存的分解により低くなる。複製前複合体の構成分子であるCDT1と結合し、複製前複合体の形成を阻害する。CDT1はchromatin licensing and DNA replication factor 1で、細胞周期において、染色体の複製が正確に1回だけ行われることを保証するライセンス化制御因子の1つで、一度複製された染色体が再複製されないように制御する。その発現はG1期に高く，S期ではユビキチン依存的分解により低くなる。細胞周期が活性化された細胞ではGemininとCDT1の発現はほぼ同じと思われる。
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