潰瘍性大腸炎合併癌における粘膜付随細菌叢の網羅的解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09331
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 光山 慶一 久留米大学, 医学部, 教授 (20200066)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 潰瘍性大腸炎 / 大腸癌 / 腸内細菌 / インターロイキン6

研究実績の概要

近年、潰瘍性大腸炎患者の急増とともに、潰瘍性大腸炎長期経過例に合併する大腸癌が増加傾向にあり、その対策が急務である。潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムはまだ不明だが、腸内細菌と粘膜免疫の相互作用が密接に関与している可能性が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。本研究では、潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムを明らかにする目的で、粘膜付随細菌叢とインターロイキン6 トランスシグナリングとの関連について検討する。
１年目である昨年度は、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いて、潰瘍性大腸炎の癌化に関与する粘膜付随細菌叢の検討を行った。その結果、潰瘍性大腸炎患者の腸粘膜には、多数の粘膜付随細菌叢が存在することを明らかにした。
2年目である本年度は、大腸癌やクローン病での粘膜付随細菌叢を検討し潰瘍性大腸炎との比較を行うとともに、インターロイキン6 トランスシグナリングの関連因子（IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素 等）との関連を検討した。
本研究によって、腸粘膜内に棲息する細菌による免疫細胞でのインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化が潰瘍性大腸炎の癌化に関与していることが明らかになれば、潰瘍性大腸炎の癌化予防や治療へとつながっていくことが期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

潰瘍性大腸炎からの発癌には、腸内細菌と粘膜免疫との相互作用の関与が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。
本研究では、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討を行う。
粘膜付随細菌叢の解析は、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いて検討中である。まず、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を用いて、ヒト潰瘍性大腸炎およびクローン病、大腸癌のホルマリン固定パラフィン包埋標本を使用した検討を行った。その結果Eub338プローブ（全細菌を認識）を用いて粘膜付随細菌叢を検出することが可能となった。現在、LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いて凍結組織標本、ホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析を実施中である。
インターロイキン6 トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCRなどの手技を用いて、腸組織、血中でのIL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素などの発現を検討中である。

今後の研究の推進方策

本研究の最終目標は、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討することである。
粘膜付随細菌叢に関しては、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いた解析が確立しつつあるため、今後、通常大腸癌組織や、通常大腸癌の非癌部組織および潰瘍性大腸炎以外の腸炎（クローン病など）組織と、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌組織の粘膜付随細菌叢の比較解析を行っていく予定である。さらに糞便中の腸内細菌叢との比較も行う予定である。
インターロイキン6 トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCR、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法などの手技を用いて、腸組織のみならず血中でのインターロイキン6 トランスシグナリングの関連因子（IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素 等）の発現を検討中である。
最終的には、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析結果と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析の解析結果の関連を比較することにより、潰瘍性大腸炎の癌化のメカニズムを解明していきたい。

次年度使用額が生じた理由

（理由）
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を用いた検討は順調に進み、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜では多くの腸内細菌を認めることが明らかとなった。LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いた検討において、マウスモデルでの検討では、凍結組織標本だけでなくホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析が可能となった。一方ヒトホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析法の確立に予想以上の時間を費やしている。
（使用計画）
今年度は以下の方法でヒトFFPE標本での粘膜付随細菌叢解析法を確立する。LMD装置を用いたFFPE組織切片からの組織分離とDNA抽出法：脱パラフィン後、FFPE組織切片からLMD装置を用いて粘膜組織を切り出し、adhesiveCap 500 clear チューブを用いて回収する。単離した組織からDNAを抽出し、DNA濃度の測定を行なう。細菌16S DNA遺伝子増幅の確認：抽出DNA 1ngを鋳型として、細菌16S rDNA遺伝子全長並びにV4領域の遺伝子増幅をPCR法で実施する。V4領域の遺伝子増幅をリアルタイムPCR法で検出する。FFPE標本と凍結組織標本との比較：FFPE組織切片と凍結組織切片から調製したDNAを用いた細菌16S rDNA遺伝子メタゲノム解析結果を比較する。

研究成果

• [雑誌論文] Detection of calprotectin in inflammatory bowel disease: Fecal and serum levels and immunohistochemical localization. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shuhei Fukunaga, Kotaro Kuwaki, Keiichi Mitsuyama, Hidetoshi Takedatsu, Shinichiro Yoshioka, Hiroshi Yamasaki, Ryosuke Yamauchi, Atsushi Mori, Tatsuyuki Kakuma, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Medicine 巻: 41 ページ: 107-118
  • DOI: 10.3892/ijmm.2017.3244
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Rare Case of Ulcerative Colitis with Neurofibromatosis Type 1 (2018)
  • 著者名/発表者名: Shuhei Fukunaga, Hidetoshi Takedatsu, Keiichi Mitsuyama, Takuji Torimura
  • 雑誌名: The Kurume Medical Journal 巻: 64 ページ: 25-27
  • DOI: 10.2739/kurumemedj.MS00014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Study to determine guidelines for pediatric colonoscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: Shinichiro Yoshioka, Hidetoshi Takedatsu, Shuhei Fukunaga, Kotaro Kuwaki, Hiroshi Yamasaki, Ryosuke Yamauchi, Atsushi Mori, Hiroshi Kawano, Tadahiro Yanagi, Tatsuki Mizuochi, Kosuke Ushijima, Keiichi, Mitsuyama, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
  • 雑誌名: World Journal of Gastroenterology 巻: 23 ページ: 5773-5779
  • DOI: 10.3748/wjg.v23.i31.5773
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stereomicroscopic features of colitis-associated tumors in mice: Evaluation of pit pattern. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ryosuke Yamauchi, Ken Kominato, Keiichi Mitsuyama, Hidetoshi Takedatsu, Shinitiro Yoshioka, Koraro Kuwaki, Hiroshi Yamasaki, Shuhei Fukunaga, Atsushi Mori, Jun Akiba, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
  • 雑誌名: Oncology Letters 巻: 14 ページ: 3675-3682
  • DOI: 10.3892/ol.2017.6645
  • 査読あり
• [雑誌論文] An unusual cause of colonic stricture with polyps (2017)
  • 著者名/発表者名: Shuhei Fukunaga, Hidetoshi Takedatsu, Hiroko Muta, Keiichi Mitsuyama, Takuji Torimura
  • 雑誌名: Gut 巻: 66 ページ: 1495-1495
  • DOI: 10.1136/gutjnl-2016-312737
  • 査読あり
• [学会発表] 炎症性腸疾患患者の末梢血単核球におけるTransient receptor potential（TRP）チャネルの発現 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山崎 博、森 敦、山内亨介、福永秀平、桑木光太郎、吉岡慎一郎、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第103回日本消化器病学会総会
• [学会発表] Expression of Transient Receptor Potential Channels in Peripheral Blood Mononuclear Cells from Inflammatory Bowel Disease Patients (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamasaki H, Mitsuyama K, Meifu S, Mori A, Yamauchi R, Fukunaga S, Kuwaki K, Yoshioka S, Torimura T
  • 学会等名: DDW-2017(Meeting of the American Gastroenterological Association)
  • 国際学会
• [学会発表] Detection of Calprotectin in Inflammatory Bowel Disease: Fecal and Serum Levels and Immonohistchemical Localization (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukunaga S, Kuwaki K, Mitsuyama K, Takedatsu H, Yoshioka S, Yamasaki H, Yamauchi R, Mori A, Tsuruta O, Torimura T
  • 学会等名: DDW-2017(Meeting of the American Gastroenterological Association)
  • 国際学会
• [学会発表] マウス大腸炎関連腫瘍における実体顕微鏡を用いた観察：pit pattern の評価 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山内亨介、米湊 健、光山慶一、竹田津英稔、山崎 博、吉岡慎一郎、桑木光太郎、福永秀平、森 敦、秋葉 純、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第103回日本消化器病学会総会
• [学会発表] 当院における小児大腸内視鏡検査の現状-前処置や鎮静における実際と工夫- (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、竹田津英稔、光山慶一、森 敦、福永秀平、山内亨介、山崎 博、桑木光太郎、柳 忠宏、河野弘志、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第93回日本消化器内視鏡学会総会
• [学会発表] サーベイランス内視鏡におけるヒト潰瘍性大腸炎（UC）関連腫瘍の詳細ーマウスDSS腸炎モデル関連腫瘍の特徴も含めてー (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、光山慶一、森 敦、福永秀平、山内亨介、桑木光太郎、竹田津英稔、秋葉 純、衣笠哲史、赤木由人、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 自然脱落を来した大腸癌の1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 永田 務、鶴田 修、草場喜雄、森田 拓、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、前山泰彦、向笠道太、秋葉 純、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 便潜血陽性で施行した大腸内視鏡検査で赤痢アメーバ症の診断となった１例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 草場喜雄、鶴田 修、永田 務、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、前山泰彦、向笠道太、秋葉 純、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 診断および治療方針決定に難渋した非特異性大腸炎の一症例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 南 真平、田中寛士、渡邊裕次郎、白地美紀、梶原雅彦、鶴田 修、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 炎症性腸疾患における便中カルプロテクチン測定の有用性 (2017)
  • 著者名/発表者名: 福永秀平、桑木光太郎、光山慶一、竹田津英稔、吉岡慎一郎、山崎 博、山内亨介、森 敦、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 急性骨髄性白血病に対する移植後に併発した消化管GVHDの1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 徳安秀紀、鶴田 修、草場喜雄、永田 務、進藤洋一郎、火野坂淳、前山泰彦、向笠道太、秋葉 純、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 貧血精査にて指摘されたcollagenous colitisの1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 永田 務、鶴田 修、草場喜雄、森田 拓、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、前山泰彦、向笠道太、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 潰瘍形成GISTに対して非穿孔式内視鏡的胃壁内反切除術(NEWS)を施行した一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中島帆奈美、向笠道太、進藤洋一郎、火野坂淳、永田 務、磯辺太郎、木崎潤也、南 泰山、森田 拓、徳安秀紀、草場喜雄、秋葉 純、赤木由人、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] B型肝炎ウイルス無症候性キャリアに発症した難治性潰瘍性大腸炎の一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 荒木俊博、森 敦、福永秀平、山内亨介、山崎 博、吉岡慎一郎、有永照子、井出達也、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第109回日本消化器病学会九州支部例会、第103回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 肛門管癌（扁平上皮癌）に対して内視鏡的切除術を施行した2例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中根智幸 、鶴田 修、草場喜雄 、森田 拓、永田 務、徳安秀紀 、向笠道太 、河野弘志 、光山慶一 、鳥村拓司
  • 学会等名: 第318回日本内科学会九州地方会
• [学会発表] 腫瘍径7mmのⅡc病変の１例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 草場喜雄、鶴田 修、永田 務、森田 拓、中根智幸、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、向笠道太、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第27回大腸IIc研究会
• [学会発表] 拡大内視鏡観察がSSA/P with cytological dysplasiaの診断に有用であった１例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 永田 務、鶴田 修、草場喜雄、森田 拓、中根智幸、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、向笠道太、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第27回大腸IIc研究会
• [学会発表] 潰瘍性大腸炎におけるサーベイランス大腸内視鏡-ランダム生検と狙撃生検の比較を中心に (2017)
  • 著者名/発表者名: 光山慶一、吉岡慎一郎、鶴田 修
  • 学会等名: 25th JDDW（第59回日本消化器病学会大会、第15回日本消化器外科学会大会 合同）
• [学会発表] 鋸歯状病変を併存した大腸癌の臨床病理学的特徴 (2017)
  • 著者名/発表者名: 永田 務、鶴田 修、草場喜雄、森田 拓、徳安秀紀、進藤洋一郎、火野坂淳、向笠道太、秋葉 純、河野弘志、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第72回日本大腸肛門病学会学術集会
• [学会発表] エビデンスに基づいて再考した潰瘍性大腸炎サーベイランス内視鏡検査の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉岡慎一郎、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第110回日本消化器病学会九州支部例会、第104回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 原発性肺癌に対するニボルマブ投与に起因したと考えられる大腸炎の一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 荒木俊博、山内亨介、森 敦、福永秀平、吉岡慎一郎、鶴田 修、光山慶一、鳥村拓司
  • 学会等名: 第110回日本消化器病学会九州支部例会、第104回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 難治性術後胆管炎に続発したと考えられるAA型腸管アミロイドーシスの一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 斉東京禄、山内亨介、有永照子、石田祐介、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第110回日本消化器病学会九州支部例会、第104回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] リンパ管造影後に蛋白漏出性胃腸症が改善したTurner症候群の一例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 野見山美香、山内亨介、福永秀平、森 敦、山崎 博、吉岡慎一郎、小金丸雅道、秋葉 純、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第110回日本消化器病学会九州支部例会、第104回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同
• [学会発表] 超高齢の上腸間膜動脈閉塞症の１例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 小林哲平、高木孝太、後藤諒介、南 真平、白地美紀、梶原雅彦、小野典之、光山慶一、鶴田 修、鳥村拓司
  • 学会等名: 第110回日本消化器病学会九州支部例会、第104回日本消化器内視鏡学会九州支部例会 合同