C末端欠損HBｘ遺伝子インテグレーションによる肝発癌・悪性化機構の検討

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09334
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 須田 剛生 北海道大学, 医学研究科, 特任助教 (20447460)
• 研究分担者: 坂本 直哉 北海道大学, 医学研究科, 教授 (10334418) ; 森川 賢一 北海道大学, 大学病院, 助教 (60384377)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 肝癌幹細胞 / HBV

研究実績の概要

次世代シークエンサーの登場によりB 型肝炎関連肝がんのホールゲノムシークエ
ンスにてC 末端欠損HBx のホストゲノムへのインテグレーションが高率に認められる事が明らかとなった。我々はC 末端欠損HBx のインテグレーションが肝癌治療抵抗性・再発に関与する肝癌幹細胞を高発現する事を明らかにした。今研究では、その発現誘導機序を詳細を明らかにする為にin vitro, in vivo 実験系とともに、臨床検体を用いた検討を遂行する事を目的とした。また、C 末端欠損 HBx のインテグレーションによりおこる細胞内変化を次世代シークエンサーを用いて網羅的に検討し治療抵抗性と関与する新たな治療標的候補因子の検討を行い、B 型肝癌における治療抵抗性の機序の解明、肝癌幹細胞をターゲットとした新規治療法の開発を目標とした。
本年度は、このC末端欠損HBｘ発現肝癌細胞をヌードマウスに移植し腫瘍形成能の検討を行った。C末端欠損HBｘ発現肝癌細胞はコントロール細胞に比較して、高い腫瘍形成能を有する事を明らかにした。免疫染色にて、形成された腫瘍はＣＤ４４を高発現しているが明らかとなった。更に、C末端欠損HBｘ発現が、肝がん幹細胞を誘導する機序の検討の詳細な検討を行いLTBP1高発現が肝癌幹細胞誘導との関連がある事を確認した。今後、臨床検体を用いた検討を予定しており、今年度は臨床検体を用いた実験条件の整備を同時に行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初予定していた、動物実験における実験条件検討が終了しC末端欠損HBｘ発現細胞が高い腫瘍形成能を有する事を明らかにした
in vitro での検討を順調にすすんでいる為

今後の研究の推進方策

A
HBx(HBx/HepG2), C 末端欠損 HBx(δ30HBx/HepG2)恒常発現細胞とコントロール細胞(con/HepG2)をヌードマウスへ皮下移植する。移植２週間後より肝細胞癌に対して現在臨床で使用されている抗癌剤（5FU、CDDP）の投与群・非投与群を設定し検討する。移植６～８週後にマウスをと殺し、以下の項目を評価する。i） 5FU、CDDDP の抗癌剤感受性を、腫瘍径にて評価　ii） 腫瘍細胞を分離し（マウス由来の細胞は抗H2k[d]抗体、
死細胞は7AAD を用いて除外する）、CD44High 細胞の割合をFACS により測定する。
B
進行B 型肝癌治療予測マーカーとしてのLTBP１検討LTBP1 は分泌蛋白であり、細胞外へ分泌される.つい最近、心不全増悪時に血中LTBP2 が上昇し悪化時のマーカーとなる事が報告された（Biomarkers. 2012）。我々は当院の倫理委員会の了承後、抗ガン剤の動注療法が行われた進行B 型肝癌症例15 例においてレトロスペクティプに治療前の血清LTBP1 値と治療効果の関連を検討した。LTBP1 低値群が、治療効果が高くなる傾向を認めた。今年度は、多数例での、血清LTBP1 値と治療効果の関係、臨床因子の相関の更なる検討を行う。

次年度使用額が生じた理由

本年度、行う予定だった次世代シークエンサーを用いた検討が検体調整に時間を要し、施行されなかったため

次年度使用額の使用計画

次年度に、次世代シークエンサーを用いた検討を行う際の試薬、チップの購入代金とする

研究成果

• [雑誌論文] Retreatment with sofosbuvir, ledipasvir, and add-on ribavirin for patients who failed daclatasvir and asunaprevir combination therapy (2017)
  • 著者名/発表者名: Suda G, Ogawa K, Yamamoto Y, Katagiri M, Furuya K, Kumagai K, Konno J, Kimura M, Kawagishi N, Ohara M, Umemura M, Ito J, Izumi T, Nakai M, Sho T, Natsuizaka M, Morikawa K, Tsubota A, Shimada N, Iio E, Tanaka Y, Sakamoto N
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s00535-017-1328-z.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Safety and efficacy of daclatasvir and asunaprevir in hepatitis C virus infected patients with renal impairment. (2017)
  • 著者名/発表者名: Suda G, Nagasaka A, Yamamoto Y, Furuya K, Kumagai K, Kudo M, Terashita K, Kobayashi T, Tsunematsu I, Yoshida J, Meguro T, Kimura M, Ito J, Umemura M, Izumi T, Tsunematsu S, Sato F, Tsukuda Y, Nakai M, Sho T, Natsuizaka M, Morikawa K, Ogawa K, Sakamoto N
  • 雑誌名: Hepatol Res 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 12. doi: 10.1111/hepr.12851
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-adipogenic and antiviral effects of l-carnitine on hepatitis C virus infection (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda Y, Suda G*, Tsunematsu S, Ito J, Sato F, Terashita K, Nakai M, Sho T, Maehara O, Shimazaki T, Kimura M, Morikawa K, Natsuizaka M, Ogawa K, Ohnishi S, Chuma M, Sakamoto N
  • 雑誌名: J Med Virol 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1002/jmv.24692
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hepatitis B virus X protein impairs α-interferon signaling via up-regulation of suppressor of cytokine signaling 3 and protein phosphatase 2A (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsunematsu S, Suda G*, Yamasaki K, Kimura M, Izumi T, Umemura M, Ito J, Sato F, Nakai M, Sho T, Morikawa K, Ogawa K, Tanaka Y, Watashi K, Wakita T, Sakamoto N
  • 雑誌名: J Med Virol 巻: 89 ページ: 267-275
  • DOI: 10.1002/jmv.24643
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 3.Suda G, Ogawa K, Kimura M, Nakai M, Sho T, Morikawa K. Novel Treatment of Hepatitis C Virus Infection for Patients with Renal Impairment. (2016)
  • 著者名/発表者名: Suda G, Ogawa K, Kimura M, Nakai M, Sho T, Morikawa K
  • 雑誌名: J Clin Transl Hepato 巻: 4 ページ: 320-327
  • DOI: 10.14218/JCTH.2016.00032
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり