| 研究課題/領域番号 |
16K09351
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
伊藤 弘康 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (80373075)
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| 研究分担者 |
清島 満 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10171315)
石川 哲也 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 教授 (10288508)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | B型肝炎 / 動物モデル / HSV-TKマウス |
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| 研究実績の概要 |
B型肝炎ウイルス(HBV)は、ヒトおよびチンパンジーのみに感染し、急性肝炎・慢性肝炎・肝硬変・肝臓がんの原因となる。近年、核酸アナログ製剤の開発により、B型慢性肝炎のコントロールが可能となってきたが、ウイルスを完全に排除することは困難である。このように、未だHBVに対する十分な治療法が確立できないのは、小動物を用いた有用なHBV感染モデルの作製が困難であることが原因の一つであると考えられる。近年、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた肝炎ウイルス感染症の検討が行われている。アルブミン遺伝子エンハンサー/プロモーター下にHerpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK)の発現遺伝子を組み込み肝臓特異的に発現するように遺伝子可変したマウスと免疫不全マウスであるNOGマウスを掛け合わせたTK-NOGマウスを使用してヒト化マウスを作製する。ガンシクロビルをTK-NOGマウスに投与することにより肝細胞のみの障害・脱落が起こり、その後、ヒト肝細胞を移入することにより、マウス内でヒト肝細胞による肝臓の再構築が行われる。免疫不全マウスのため異種移植でも拒絶反応は起きず生着できる。このようなヒト化マウスは、肝細胞がヒト由来のため、HBVやC型肝炎ウイルスなどヒトにしか感染しないウイルスでも持続感染が成立し、抗ウイルス薬の検討などが行われている。しかしながら、本マウスは、前述の通り免疫不全マウスのため、本来ヒトで起きる病態を正確に反映しているとは言えず、宿主免疫応答の解析は困難である。
本研究では、HSV-TKマウスを使用し、宿主肝細胞を除去した後、HBVトランスジェニックマウスから採取した肝細胞を移入することで、新規HBV感染モデルを確立する。さらに、作製したマウスでの肝障害発症機序について免疫学的検討を中心に行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、はじめに、実験動物中央研究所より入手したHSV-TK-NOGマウス(H2Ld)と野生型(WT)マウス(H2Ld)を掛け合わせ、野生型のHSV-TK-WT（TK-WT）マウスを作製した。（HSV-TK-NOGマウスは免疫不全状態であり、正常な宿主免疫応答を検証するために野生型と掛け合わせた。) 作製したTK-WTマウスにガンシクロビルを腹腔内投与することによりHSV-TK遺伝子が導入されている肝細胞が傷害を受け脱落するが、適正なガンシクロビル投与量を検討した。適正量のガンシクロビル投与後、MHCクラスをそろえたH2LdのHBV Tgマウスの肝細胞を移入した。HBVTgマウスからの肝細胞採取は、コラゲナーゼによる還流法を用いた。（現在、申請者らによる手技では約90%の生きた肝細胞の採取可能である。）HBVTgマウスの肝細胞採取後、肝細胞を経脾臓的に移入しその後、移入した肝細胞が生着しているのを確認するため、経時的に血液および肝臓を採取した。血液中のHBｓ抗原を測定したところ、検出は困難であった。しかしながら、肝組織を用いてHBs抗原量を測定したところ検出可能であった。さらに、肝組織を用いて肝細胞内のHBs抗原量を免疫染色法にて検討したところ抗原陽性細胞をみとめた。
次に、肝細胞移入後のHBs抗原に対する宿主免疫応答を検討した。血清を使用して、HBs抗体を測定したところ、移入後、１週間で抗体の出現を認め、４から６週で抗体価ピークとなった。HBs抗原に対する細胞性免疫応答の検討を行うため、脾細胞を用いて、ELISPOTアッセイを行った。移入後、２週目でIFN-g産生細胞が多い傾向であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の検討では、TK-WTマウスを作製し、ガンシクロビル投与後、HBVTgマウスの肝細胞を移入することで、宿主の肝組織での肝細胞の置換が示唆された。しかしながら、移入したすべてのマウスで確認は困難であり、置換を確認できたのは、一部のマウスのみであった。したがって、本年度は、置換効率を上げるため、移入方法（経脾臓的または経門脈的）や移入細胞数、さらに、移入時期（ガンシクロビル投与後）を検討する。これらの検討により安定したモデルの確立を目指し、その後、宿主免疫応答の検討を行う。昨年同様、液性および細胞性免疫応答の検討を血清中のHBs抗体の測定や、ELISPOTアッセイを用いた実験をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ガンシクロビルの適正量の検討に、予想よりもマウス使用量が少なくすんだ。
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| 次年度使用額の使用計画 |
モデルマウスの作製のため、より適切な方法の検討に使用する。また、より詳細な免疫応答の解析のため、フローサイトメーターに使用する抗体の種類を増やす。
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