| 研究課題/領域番号 |
16K09401
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
眞嶋 浩聡 自治医科大学, 医学部, 教授 (10261869)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 急性膵炎 / S100g / ANXA10 / アミラーゼ分泌 / 細胞内カルシウム |
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| 研究実績の概要 |
1.野生型マウスにおけるS100g, Anxa10の挙動の確認
過剰量のセルレインを7-12回腹腔内に投与し、浮腫性膵炎を惹起させるとS100gはmRNAレベル、蛋白レベル両者において発現の亢進がみられ、Anxa10はmRNA、蛋白の無からの発現を認めた。免疫染色では、S100gは側方基底膜寄りの細胞質が染まった細胞がまだらに出現し、膵炎の進展と共に膵臓全体に広がっていったのに対し、Anxa10は細胞質全体の染色性が亢進していった。原因か結果かは不明であるが、これらの分子は膵炎発症に関与している可能性が高いと考えられる。
2.ラット膵腺房細胞株を用いたin vitroでの検討
ラット膵腺房細胞癌由来のAR42J細胞にS100gを過剰発現させた細胞(AR42J-S100g)、Anxa10を過剰発現させた細胞(AR42J-Anxa10)を樹立した。コレシストキニン(CCK-8)刺激によるアミラーゼ分泌、fura-2を用いた[Ca2+]iの変化をコントロール細胞(AR42J-GFP)と比較検討した。100pM CCK-8による分泌刺激では、AR42J-S100gではアミラーゼ分泌が著明に抑制されたのに対し、AR42J-Anxa10ではごくわずかに抑制されたのみであった。AR42J-S100g細胞では、CCK-8刺激による細胞内Ca濃度の上昇が著明に抑制されたが、AR42J-Anxa10ではその抑制はわずかであった。S100g過剰発現AR42J細胞では細胞内Ca濃度の上昇、アミラーゼ分泌が顕著に抑制された。Anxa10も同様の傾向であるが、その作用は弱かった。急性膵炎発症初期にみられる外分泌不全にS100gが関与している可能性が示唆された。
siRNAを用いてS100gの発現をノックダウンし、上記と逆の結果が見られるかを検討したが、AR42J細胞ではうまくノックダウンが出来なかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1.S100g KOマウス
韓国Chungbuk National UniversityのEui-Bae Jeung教授からS100g KOマウスを供与してもらった。秋田大学からさいたま医療センターへ移送するに際しての書類の整備に時間を要し、2016.10月に到着した。現在交配によって使用可能なマウスが増えてきたところである。既報通り、生理条件下では異常を呈さず、繁殖にも問題は見られない。今後このマウスを利用して解析を進めていく予定である。
2.S100gノックダウン（in vitro実験）
上述のように、AR42J細胞ではsiRNAによるノックダウン効率が低く、実験を遂行することができなかった。レトロウイルスやレンチウイルスを用いてshRNAを恒常的に産生する細胞を樹立して検討する必要があると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
S100g KOマウスを用いた解析を進める。
① 単離腺房を用いての検討：コレシストキニン(CCK-8)刺激によるアミラーゼ分泌、fura-2を用いた細胞内カルシウム濃度（[Ca2+]i）の変化を野生型マウスと比較検討し、S100gの機能解析を行う。
② セルレイン膵炎（浮腫性膵炎）、L-アルギニン膵炎（壊死性膵炎）を惹起した時に見られる膵炎反応（細胞内トリプシンの異所性活性化、NF-kBの活性化、オートファジー不全、酸化ストレス、小胞体ストレスなど）を野生型マウスと比較検討し、S100gと急性膵炎の関係性を明らかにする。また、その時に[Ca2+]iがどのように変化するかを電気生理学的に検討する。プレリミナリーな結果であるが、S100g KOマウスではセルレイン膵炎が軽減するようである。S100gはカルシウム結合蛋白であり、[Ca2+]iの異常な上昇を抑制して膵炎を軽減する方向に作用する、つまりS100g KOマウスでは急性膵炎が増悪するものと想定していたが、カルモジュリン(Gerasimenko JV et al. PNAS 108:5873-78,2011)などの作用とは異なるようである。今後、詳細に機能解析を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1000円未満の額であり、使用しきれなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品代として使用する。
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