2016 年度実施状況報告書

膵癌における肝転移の分子機序の解明と新規血清バイオマーカーの確立

研究課題

研究課題/領域番号	16K09408
研究機関	徳島大学
研究代表者	宮本弘志徳島大学, 病院, 講師 (90398024)
研究分担者	高山哲治徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 教授 (10284994) 岡本耕一徳島大学, 病院, 講師 (60531374)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	膵癌 / 超音波内視鏡下穿刺吸引術 / 肝転移 / マイクロRNA
研究実績の概要	１．膵癌患者において肝転移に関わるマイクロRNAをこれまでマイクロRNAアレイを行い4個同定している(mir-144-3p、mir-150-3p、mir-200c-3p、mir-4237)。この4個のマイクロRNAについて、病理学的に膵管癌と診断された患者のホルマリン固定後サンプルを用いて、肝転移の有無別に15例ずつTaqman miRNAアッセイによりvalidationを行った。4個のマイクロRNAのうち3個は発現亢進、1個は低下していることが膵管癌患者においても確認された。２．膵癌細胞株を用いた実験の準備として、HPAF-II、PANC-1、PL45の3種類の細胞株を培養している。上記でvalidationされたマイクロRNA において、発現亢進のマイクロRNAについては、阻害する物質、発現低下のマイクロRNAには発現を亢進させる物質をそれぞれ入手しており、細胞の遊走能に与える変化をマイグレイションアッセイ、浸潤能に与える変化をインベイジョンアッセイを行い、現在検討中である。３．膵癌細胞株のエクスプレッションアッセイを用いて、遺伝子発現解析も順次行っている。まだ途中ではあるが、IPA解析およびターゲットスキャンのデータベースを用いて、それぞれのマイクロRNAのターゲットとなる遺伝子を絞り込んでいるところである。遺伝子が確定すれば、膵癌細胞株を用いて、各遺伝子のReal Time PCR によるvalidationを行う予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由膵癌ホルマリン固定後検体を用いたマイクロRNAのvalidationについては、当初の予定通り終了し、4個のマイクロRNAがそれぞれ発現亢進、低下していることを確かめることができた。しかし、膵癌細胞株を用いたマイクロRNAによる遊走・浸潤能に対する影響の検討については、3種類のすべての細胞株について、まだ実験が終了しておらず、現在実験をしているところである。エクスプレッションアッセイおよびIPA解析等によるターゲット遺伝子の検索については、膵癌細胞株を用いた実験が途中のため、まだ絞り込みの途中である。また、各遺伝子のReal Time PCR によるvalidationもまだ、施行できていない。さらに、各遺伝子ノックアウト株の樹立と細胞特性のin vitro 評価については、まだ手つかずの状況である。したがって、平成28年度の進捗状況としては、まったく手つかずのものはほとんどないが、まだ検討中の実験が多いため、やや遅れていると判断している。原因としては、膵癌症例のうち肝転移の有無でそれぞれ15例ずつを集めるところで、肝転移有りで十分量の検体量を有する症例収集に時間がかかったこと、そのため膵癌細胞株の実験開始が遅れてしまったことが考えられる。今後はin vitro実験が主であり、遅れを取り戻すべく実験を行う予定である。
今後の研究の推進方策	膵癌肝転移に関わる各遺伝子のノックアウト株の樹立と細胞特性のin vitro 評価を行う。次にマウスを用いた動物実験を行い、ターゲット遺伝子のノックアウト膵癌細胞株を用いて、実際に肝転移について検討する。さらに、膵癌患者から得られた組織を用い、マイクロRNA、ターゲット遺伝子および蛋白のin situ hybridizationおよび免疫組織染色を行い、発現を検証する。以上の検証で証明されたマイクロRNA、ターゲット遺伝子について、膵癌肝転移予測に対する感度、特異度からROC曲線を用いた解析を行うことにより、最も膵癌肝転移に対する予測が可能なマイクロRNA、ターゲット遺伝子の組み合わせを決定し、新規血清バイオマーカーの同定を目指す予定である。
次年度使用額が生じた理由	次年度に、マウスを用いた動物実験を行い、ターゲット遺伝子のノックアウト膵癌細胞株を用いて、実際に肝転移について検討する。さらに、膵癌患者から得られた組織を用い、マイクロRNA、ターゲット遺伝子および蛋白のin situ hybridizationおよび免疫組織染色を行い、発現を検証する。以上の検証で証明されたマイクロRNA、ターゲット遺伝子について、膵癌肝転移予測に対する感度、特異度からROC曲線を用いた解析を行うことにより、最も膵癌肝転移に対する予測が可能なマイクロRNA、ターゲット遺伝子の組み合わせを決定し、新規血清バイオマーカーの同定を目指す予定であるため。
次年度使用額の使用計画	動物実験に伴い動物の購入や、ターゲット遺伝子のノックアウト膵癌細胞株の作成、膵癌患者から得られた組織を用い、マイクロRNA、ターゲット遺伝子および蛋白のin situ hybridizationおよび免疫組織染色などにおける消耗品の購入など。ずれ込んだ膵癌細胞株の実験のために、次年度で4406円使用する予定である。