| 研究課題/領域番号 |
16K09503
|
|---|
| 研究機関 | 愛媛大学 |
|---|
研究代表者 |
青野 潤 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (70512169)
|
|---|
| 研究分担者 |
末廣 千佳 愛媛大学, 医学部附属病院, 医員 (00770356)
坂上 智城 愛媛大学, 総合健康センター, 学校医 (40725917)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 大動脈弁狭窄症 / マイクロアレイ解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
①非心臓死剖検症例、大動脈弁狭窄症患者、大動脈弁閉鎖不全症患者からヒト大動脈弁を採取しリアルタイムPCRを施行したところテロメラーゼの酵素サブユニットであるtelomere reverse transcriptase（TERT）の遺伝子発現が正常弁、大動脈弁閉鎖不全症の大動脈弁（手術検体）と比較し大動脈狭窄症弁で亢進していた。
②ブタ大動脈弁から採取したAVICsを用いた予備実験を参考に、in vitro calcification assayを確立した。大動脈弁はもともと構成細胞が少なく、またそのその弁より採取した細胞を用いた培養実験では形質転換など細胞の特性変化により、in vitro 解析が困難な場合もあったが、我々は１細胞から細胞特性を維持したまま培養する新規低酸素培養法を導入することで系の最適化に成功した。これにより生体内により近い状態で効率的に細胞を増殖させることが可能であり、効率的に研究を進めていくことが可能になった。本法をもとにヒト大動脈正常弁（非心臓死剖検症例）と狭窄弁（手術検体）よりAVICsを採取し石灰化刺激を施行した。
③それら大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行いマイクロアレイ解析によりその遺伝子発現プロファイルを詳細に解析した。その結果、石灰化刺激により顕著に発現上昇している遺伝子を533種、また発現低下している遺伝子として476種を同定することに成功した。これらの中にはカテプシンKなど従来AS患者由来弁の網羅解析などで同定された遺伝子も多く含まれていたが、機能未知の新規の遺伝子も多数含まれていた。現在この結果に基づいてPathway解析を実施しており、弁膜の石灰化に関与すると考えられている遺伝子 （BMP-2、BMP-4、Runx2、Ostepontin、Alkaline phosphatase）とともにテロメラーゼとの関連を明らかにする予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
TERTの蛋白を検出するのにウエスタンブロッティングを施行しているが非特異的バンドが出現しそのバンドが確実にTERTの蛋白質であるという確証が得られず現在他の抗体を選定中である。TERTのELISAも購入し検出を試みたが値がばらつくため手法を検証している。
テロメラーゼ活性をTRAP assay (Telomeric Repeat Amplification Protocol)を用いて解析しようと試みたがアッセイがうまくいかずキット販売業者とも相談し解決策を模索している。遺伝子ノックダウンさせるためのウイルスベクターなど作成したがノックダウンがうまくいかず、現在ターゲット遺伝子をCRISPR-Cas9系でノックアウトするレンチウィルスシステムを民間企業と連携して進めている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
マイクロアレイで解析し見出した遺伝子プロファイルのうち同定した大動脈弁狭窄症に対し機能未知の因子に対して大動脈狭窄症弁を用いて免疫組織染色を実施したところ、驚くことにVon Kossa陽性の石灰化領域で強い染色が認められたが、非石灰化領域、剖検例から得られる正常弁には染色は全く認められなかったものが多数含まれていた。これらの結果に加えて大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行いTERTをCRISPR-Cas9系でノックアウトしマイクロアレイで解析することで大動脈弁間質細胞の石灰化におけるTERTの役割を網羅的に解析したいと考えている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
網羅解析用の試薬、レンチウイルスのシステムを作成するまでに患者背景の揃ったサンプルの採取・保存が進まなかったため助成金を持ち越すことになった。患者背景を揃えたサンプルが集まっているため平成３０年度は大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行いTERTをCRISPR-Cas9系でノックアウトしマイクロアレイで解析することで大動脈弁間質細胞の石灰化におけるTERTの役割を網羅的に解析し見出した因子を大動脈弁狭窄症患者の大動脈弁、剖検症例の正常弁を免疫染色することでその発現を確認する予定である。
|
