2018 年度実施状況報告書

テロメア合成酵素が大動脈弁狭窄症の発症・進展に与える影響

研究課題

研究課題/領域番号	16K09503
研究機関	愛媛大学
研究代表者	青野潤愛媛大学, 医学部附属病院, 講師(病院教員) (70512169)
研究分担者	末廣千佳愛媛大学, 医学部附属病院, 医員 (00770356) 坂上智城愛媛大学, 総合健康センター, 学校医 (40725917)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2020-03-31
キーワード	マイクロアレイ / 網羅解析 / 大動脈弁狭窄症
研究実績の概要	①大動脈弁狭窄症患者より採取した大動脈狭窄弁を石灰化部、非石灰化部に分割しそれぞれ大動脈弁間質細胞を採取した。また正常部より採取した大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を行い、それぞれマイクロアレイ解析を施行した。 ②石灰化部から採取した大動脈弁間質細胞と石灰化刺激を行った大動脈弁間質細胞で同様の動向を示す遺伝子群をピックアップした。 ③その中でカルシウム・リン代謝の調節機能を有する一つの分泌タンパク質（Protein X）の同定に成功した。本タンパク質と大動脈弁狭窄症との関連についての報告はなく、i)弁石灰化部周辺に浸潤する間質細胞に高発現すること、ii)弁間質細胞の骨芽細胞分化依存的に細胞外に分泌されることから、薬物による大動脈弁狭窄症治療標的あるいは早期発見のバイオマーカーとして有望である。④Protein Xにも注目し今後の研究を進めていく予定である。 ⑤テロメア合成酵素に関してはELISAやTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) assayなどを使用し確認しているが、その発現、活性が弱く、結果にもバラツキを認めるため新たな評価方法を模索している。 ⑥テロメア合成酵素の新たな評価法を模索しつつ今回の解析で見出した因子の解析を進め大動脈弁狭窄症の発症・進展における分子機序解明を目指す。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由石灰化を認めない大動脈閉鎖不全症患者の弁と大動脈弁狭窄症患者の弁からmRNAを抽出してQPCRを施行したところ大動脈弁狭窄症患者の弁ではテロメア合成酵素の主要構成成分であり、遺伝子の転写調節に関与していると報告されているテロメア逆転酵素（ Telomerase Reverse Transcriptase : TERT）の遺伝子発現が亢進していた。これらの結果についてELISAやTelomeric repeat amplification protocol (TRAP) assayなどを使用し確認しているが、その発現、活性が弱く、結果にもバラツキを認めるため新たな評価方法を模索している。本研究の中で大動脈弁の正常部、硬化部、石灰化部より採取した大動脈弁間質細胞と正常部より採取した大動脈弁間質細胞に石灰化刺激を施行しそれぞれマイクロアレイを用いた網羅解析を行った。正常部、硬化部由来の大動脈弁間質細胞の遺伝子発現には差を認めなかったが正常部・硬化部と石灰化部由来の細胞を比較すると有意に発現に差を認める遺伝子を見出した。同様に正常部由来の大動脈弁間質細胞に人工的石灰化刺激を行い同様にマイクロアレイによる網羅解析を行い、石灰化由来大動脈弁間質細胞と石灰化刺激された正常大動脈弁間質細胞で有意な変化があった遺伝子群をピックアップして解析を進めている。その中でカルシウム・リン代謝の調節機能を有する一つの分泌タンパク質（Protein X）の同定に成功した。本タンパク質と大動脈弁狭窄症との関連についての報告はなく、i)弁石灰化部周辺に浸潤する間質細胞に高発現すること、ii)弁間質細胞の骨芽細胞分化依存的に細胞外に分泌されることから、薬物による大動脈弁狭窄症治療標的あるいは早期発見のバイオマーカーとして有望である。今後はこのProtein Xにも注目し今後の研究を進めていく予定である。
今後の研究の推進方策	テロメア合成酵素の活性と石灰化を認めない大動脈弁と大動脈弁狭窄症患者の弁でQPCR上遺伝子発現が亢進していたTERTタンパク発現を確認するための新たな評価方法を検討する。加えて網羅解析で見出した遺伝子群について解析を進めていく。現在その一つである分泌タンパク質（Protein X）についての解析は進めており、実際の大動脈狭窄弁での免疫染色、大動脈弁間質細胞においてProtein Xをノックダウンまたは過剰発現させることで石灰化への影響を検討する予定である。最終的に石灰化への影響が確認されたら大動脈弁狭窄症マウスモデルを用いて遺伝子欠損マウス、過剰発現マウスを使用し病態の発症・進展への影響を検討する予定である。
次年度使用額が生じた理由	研究を進める上で網羅解析で見出した因子のタンパク発現量測定するのにウエスタンブロッティング、ELISAなど用いたが再現性のある測定結果を得ることができず現在新たな方法を模索しており次年度に繰り越すことになりました。また大動脈弁間質細胞のTERT遺伝子をCRISPR-Cas9システムを用いてノックダウンする予定であり現在そのノックダウン効率を確認しており、その確認にも時間を要している。これらの結果より翌年度分として請求させて頂き上記の解決に務めたいと思います。