| 研究課題/領域番号 |
16K09623
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
草場 哲郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60367365)
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| 研究分担者 |
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | CRISPR/Cas9 / 遺伝子改変 / 腎臓 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、新規遺伝子改変方法であるCRISPR/Cas9システムに従来のCre-LoxPシステムを組み合わせることにより、成体の腎臓で後天的かつ組織特異的に複数遺伝子の改変を行う方法の確立を目的として計画された。昨年度の研究計画は、Vitroにおいては蛍光色素であるtdTomatoに対するgRNAの設計と、それが実際に機能するかどうかを確認すること、Vivoにおいては腎臓特異的にCas9蛋白、tdTomatoを発現する遺伝子改変マウスを作成すること、であった。
tdTomatoに対するgRNAを3種類作成し、各々の遺伝子改変効率をFACSにより確認し、最も効率の良かった配列を決定した。そしてそのgRNA配列をCas9発現レンチウィルスベクターに挿入し、最終的にレンチウィルス液を得た。当初はレンチウィルスを用いて、Cas9蛋白とtdTomato蛋白を発現するHEK293細胞を作成する予定であったが、上述のCas9蛋白とgRNAを発現するレンチウィルスを作成できたこと、他研究者よりtdTomato蛋白を恒常的に発現しているラット尿細管上皮細胞を譲渡されたことから、この細胞株にレンチウィルスを感染させ、gRNAの機能確認を行った。FACSを用いた解析では、tdTomatoの発現の消失を認めた。また塩基配列を確認したところ、tdTomato遺伝子内に1塩基挿入変異を認めた。
Vivoでは近位尿細管上皮特異的Tamoxifen誘導性Cre発現マウス、Cre依存的にCas9を発現するマウス、Cre依存的にtdTomatoを発現するマウスを相互に交配し、現在3つの遺伝子変異を有する改変マウスを作成中である。
以上のことから、tdTomatoに対するgRNAは作成できており、今後はマウスの完成を待って、Vivoでの後天的遺伝子改変実験を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度の研究計画では、In Vitroの実験においてtdTomatoに対するgRNAの設計、そしてその機能確認を行う予定であった。レンチウィルスを用いてgRNAを細胞に導入し、tdTomato蛋白の発現の消失をFACSで確認しており、また塩基配列の検討でもCRISPR/Cas9システムによりtdTomato遺伝子が改変されていることを確認している。これらのことからVitroの研究における当初の研究計画は達成されたと判断される。
またVivoの研究計画では、近位尿細管上皮特異的Tamoxifen誘導性Cre発現遺伝子、Cre依存性Cas9発現遺伝子、Cre依存性tdTomato発現遺伝子の3つの遺伝子変異を有する改変マウスを作成予定であったため、当初より交配し作成するには1年以上時間を有することを予定していた。現在、3つの変異遺伝子を有するマウス仔を既に得ており、今後それらの成長を待ってTamoxifenの投与を行い、Cas9蛋白やtdTomato蛋白の発現解析を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
作成した3種類の変異遺伝子を有する改変マウスは、理論上タモキシフェン投与後にCas9蛋白、tdTomato蛋白を発現するが、発現部位や蛋白発現量を定量化する必要がある。
そこでマウスが成長すれば、まずTamoxifen 3mgを3回、Triple transgenicマウスに腹腔内投与し、腎臓でのtdTomatoの発現部位とCas9蛋白の発現部位を免疫多重染色により解析する予定である。またオフターゲット効果を否定するために、同時に肝臓、脳、消化管をはじめ全身諸臓器も同時に解析し、Cas9蛋白の発現が他の臓器で生じていないかも確認する。
予想通りにCas9蛋白とtdTomato蛋白が発現していることが確認できれば、このマウスに対してtdTomatoおよびCas9蛋白を十分に発現させることのできる量のTamoxifen(3mgの腹腔内投与を3回の予定)の投与を行い、近位尿細管にCas9およびtdTomato蛋白を発現させる。その1週間後に、tdTomatoに対するgRNA(1nmol)とマイクロバブルの混合液を下大静脈より投与し、その直後に右腎に超音波プローベを押し当て1分間の超音波照射を行い、gRNAが効率的に細胞内に取り込まれるように誘導する。するとCas9蛋白とgRNAが複合体を形成した後核内に移行し、tdTomato遺伝子を改変させることが期待できる。2週間経過したところでマウスを安楽死させて腎組織を摘出し、免疫染色、およびWestern blot法により組織内のtdTomato発現の左右差を比較することで遺伝子導入効率を検討する。
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