| 研究課題/領域番号 |
16K09627
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
井上 勉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406475)
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| 研究分担者 |
岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60233342)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 腎線維化 / CCN2 / 慢性腎臓病 |
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| 研究実績の概要 |
CCN2（旧称CTGF: connective tissue growth factor）の機能制御による、新規慢性腎臓病治療戦略の開発を目指して、計画通りの研究を進めている。Cre-LoxPシステムを用いて、①whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウス、②モジュールXX欠損CCN2発現トランスジェニックマウスを用い、①片側尿管結紮モデル、②虚血再灌流モデル、③腎亜全摘モデルを作成し、病変の進行速度の変化とCCN2モジュールXXが線維化に関わる機序に焦点を当てて解析中である。昨年度中に予定していたサンプルの取得を完了した片側尿管結紮モデル、虚血再灌流モデルについて、RT-PCR、Western blottingを用いて、細胞外基質、炎症性サイトカイン、線維化に関わるサイトカインの産生量をmRNAレベルで、幾つかの細胞内シグナル伝達系に関する検証をリン酸化シグナルの変化で検討を行った。結果、whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウス、モジュールXX欠損CCN2発現トランスジェニックマウスの双方で、いずれのモデルにおいても腎線維化の進行が統計学的にも有意に抑制されていた。mRNAレベルではコラーゲン、フィブロネクチンの発現抑制に加え、TGF-bやPAI-1など腎病変進行の際のkey moleculesの発現も同様に有意な抑制が確認された。細胞内のシグナル伝達系については、インテグリン－FAK（focal adhesion kinase）のリン酸化の抑制が顕著であり、関連する（下流と考えられる）幾つかの分子についてもリン酸化の抑制が確認された。CCN2-インテグリンの相互作用について確証を得るために、①中和抗体を用いた阻害実験、②デコイペプチドを用いた阻害実験、③CCN2陰性培養線維芽細胞を得て正常CCN2の強制発現系での検討を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
度々報告している腎亜全摘モデルにおけるモデル作成の歩留まりの悪さが影響して、同モデル作成に関する一部の計画は大きな遅延、予定の変更を余儀なくされた。昨年の報告の通り、マウスストレインの変更（腎門部の剖出が容易で血管系の結紮が行いやすい系統）で上記の問題を解決し、予定数のサンプルを得ることが出来た。しかし解析に際して、結紮モデルでは評価対象となる部位の周辺に虚血壊死後の瘢痕組織が隣接しており、通常通りwhole kidneyをサンプルとすると正確な評価が不可能であった。そこでレーザー光を用いたマイクロダイセクション法を試みた。正常組織ではマニュアル通りの方法で良好な結果が得られたが、線維化が進行した組織では、レーザー光を最小限に絞っても組織の焼灼が生じてしまい、当該箇所のみを切り出すことが困難であった。未固定のサンプルをビブラトームで薄切し、実体顕微鏡下で用手的に組織を切り分ける方法は、未染色では組織状態の把握が難しく作業が困難であったり、染色過程が原因と思われるRNAの断片化の問題があり難渋している。Western blottingを行うに十分量のタンパクサンプルを収集することが難しく、他の方法（プロテインアレイなど）は予算の問題で施行の目処が立っていない。他のモデルを用いて研究目標は十分に達成しつつあるが、一部の研究計画は未完のままとなる可能性も生じてしまっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本課題は「追加（再現）実験の実施や学会参加、論文投稿」の目的で1年の期間延長をお願いした。インテグリンはCCN2の特異的受容体では無く、CCN2の作用がFAKのリン酸化に直接影響するか否かを検証する必要があり、従来予定してたデコイペプチドによる阻害実験の他にも、各モジュール特異的中和抗体を用いた追加実験、さらに、我々が用いた遺伝子改変マウスから初代培養細胞を取得し、同細胞に正常CCN2を強制発現させた際のFAKや線維化形質の変化（正常CCN2の遺伝子導入のみで形質が正常化するか否か）を検討する必要があると考えている。これらの追加実験結果も含めて、2019年度の学会・研究会での発表および論文作成を予定している。
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