| 研究課題/領域番号 |
16K09654
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
野々口 博史 北里大学, 北里大学メディカルセンター, 医員 (30218341)
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| 研究分担者 |
泉 裕一郎 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (20736243)
安岡 有紀子 北里大学, 医学部, 講師 (50348504)
河原 克雅 北里大学, 医学部, 名誉教授 (70134525) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | エリスロポエチン / 低酸素 / 貧血 / ウェスタンブロット / 脱糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
造血ホルモンであるエリスロポエチンの血中、尿中および組織中からの蛋白の検出について、前年度に引き続き、検討を行った。尿中エリスロポエチンは、重度の貧血患者さんの尿で検出を試みた。まず、加熱遠心法での尿濃縮を行ったが、濃縮が強くなれば、サンプル中の塩濃度が高くなり、ウェスタンブロットでバンドのゆがみが生じた。そこで、vivaspinを用いての濃縮を来なったところ、5mlから10μｌへの500倍濃縮を行っても、バンドがゆがまないことが分かった。
次に血漿からのエリスロポエチン蛋白の検出を行った。血漿をそのまま用いても、非特異的バンドの影響などで、エリスロポエチンのバンドは検出できなかった。エリスロポエチンは、糖蛋白なので、PNGaseを用いて、脱糖鎖を行った。脱糖鎖試薬と20時間インキュベートしたが、PNGaseなしでも、34－43kDaに幅広いバンドを認め、PNGaseでの脱糖鎖で22kDaにバンドがシフトすることが分かった。脱糖鎖を行うことで、検出感度が少なくとも10倍以上上昇することも明らかとなった。
7％酸素4時間というエベレスト頂上と同程度の低酸素4時間で、腎でのエリスロポエチン産生が増えることも明らかとなった。ただ、普通のウェスタンブロットでは、増加率は10倍程度であり、脱糖鎖試薬とのインキュベート(PNGaseなし）で20倍程度であったが、脱糖鎖後のエリスロポエチンは、200倍増加していることが明らかとなった。一方、肝臓では、低酸素にしても脱糖鎖後のエリスロポエチンはほとんど検出できなかった。
以上より、エリスロポエチンは、尿では濃縮して、血漿は脱糖鎖試薬とのインキュベートで検出できるが、脱糖鎖したエリスロポエチンの方が検出感度がよく、より正確に測定できることが明らかとなった。低酸素に反応するのは腎で肝は反応しないことも明らかとなった。
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