| 研究課題/領域番号 |
16K09689
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター |
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研究代表者 |
高橋 祐二 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 病院, 部長 (00372392)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / ErbB4 / 培養細胞 / 細胞内局在 / 突起伸長 / コンディショナルノックアウトマウス |
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| 研究実績の概要 |
【目的】筋萎縮性側索硬化症（ALS）の新規病因遺伝子産物ErbB4が運動神経細胞死をもたらすメカニズムを解明する。【方法】①Neuro2A細胞に野生型・変異型ErbB4を遺伝子導入した一過性発現系において、細胞内局在を分析する。MTTアッセイにより細胞生存率を評価する。②マウス大脳皮質由来初代培養神経細胞に対して野生型・変異型ErbB4の遺伝子導入を行い、突起伸長、細胞の生存について比較する。③タモキシフェン依存性運動神経細胞特異的ErbB4コンディショナルノックアウト(cKO)マウスを作成し、ErbB4の発現喪失が運動神経細胞死をもたらすかどうかについて、in vivoで検証する。【結果】①Neuro2A細胞を用いた一過性発現系 野生型・変異型ErbB4で細胞内局在に差異が認められた。また、変異型は野生型と比較して有意に生存率が低下していた。②初代培養神経細胞において、野生型・変異型で突起伸長・細胞生存率に差異が認められた。③Erbb4 flox/floxマウスと129-Chattm1(cre/ERT)Nat/Jそれぞれについて、マイクロサテライトを用いたスピードコンジェニック法を活用して、B6系統へのBackcrossによる純化を進めた。同時に、129-Chattm1(cre/ERT)Nat/JとCre-LacZマウスを掛け合わせたマウスを作成し、タモキシフェンによるCre誘導の条件検討を行い適切な投与方法を決定した。【考察】培養細胞系で野生型と変異型の局在・細胞生存の差異が認められ、本変異の病原性を支持する結果が得られた。今後変異型の細胞内局在部位の分析を進める。また、cKOマウスの作成も期間内に順調に進んだ。次年度はcKOマウスの表現型の分析を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①②培養細胞系を用いた変異の機能解析 本研究ではNeuro2A細胞およびマウス大脳皮質由来初代培養神経細胞を用いた一過性発現系の系を確立し、機能解析を行う土台を確立した。また、野生型と変異型の細胞内局在・細胞生存率の差異を明らかにした。変異導入によって予想以上に顕著でかつ再現性良好な違いが認められており、病態メカニズムの解明につながる新規データが得られた。
②タモキシフェン依存性運動神経細胞特異的ErbB4コンディショナルノックアウト(cKO)マウスの作成 マウスの購入にやや時間を要したが、マイクロサテライトを用いたスピードコンジェニック法を用いたことにより、純化のステップを効率化することが可能になった。また、Cre-LacZ マウスとのダブルトランスジェニックマウスの活用により、適切なタモキシフェン投与の条件設定も完了した。
以上、期間内に順調に研究は進捗した。
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| 今後の研究の推進方策 |
①Neuro2A細胞を用いた解析 変異型ErbB4の細胞内局在異常のメカニズムを解明する。ALS病態関連分子との共局在を明らかにする。細胞内トラフィッキング機構に着目する。細胞死に至るパスウェイを明らかにする。また、リガンドであるNRGの刺激による変化も明らかにする。下流のシグナリングの障害を分析する。関連する分子が同定された場合、ALS患者由来剖検組織で検証する。
②マウス大脳皮質由来初代培養神経細胞を用いた解析 突起伸長に関わるメカニズムと野生型・変異型ErbB4との関連を明らかにする。突起伸長に関わる最初期遺伝子の発現とErbB4との関連に着目して分析する。NRGの刺激による変化も明らかにする。下流のシグナリングの障害を分析する。関連する分子が同定された場合、ALS患者由来剖検組織で検証する。
③タモキシフェン依存性運動神経細胞特異的ErbB4コンディショナルノックアウト(cKO)マウスの作成 年度内に作成を完了し、タモキシフェンを投与し、表現型・病理所見を解析する。
以上、当初の予定通りに研究を遂行する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コンディショナルノックアウトマウス作成において、スピードコンジェニック法の活用により、当初より少ない世代数で順調に純化を進めることが出来たこと。また、培養細胞を用いた実験が予想以上に順調に進捗し、実験系の確立に必要な消耗品の支出を抑えられたことが大きな理由である。マウスについては研究所に保管されているStrainを有効に活用することにより、マウス購入にかかる費用を節約できたことも理由に挙げられる。次年度には培養細胞系を用いたメカニズム解明・コンディショナるノックアウトマウスを用いた表現型・病理学的分析を本格的に進める予定であり、次年度使用額を有効に活用して大きな研究成果をあげることが出来ると考えられる。
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