| 研究課題/領域番号 |
16K09758
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
佐藤 叔史 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (90622598)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 低酸素 / 膵β細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、①低酸素によるβ細胞障害分子メカニズムの解明、②糖尿病膵島の低酸素化機序の解明、および③β細胞低酸素化に対するGLP-1の防御機構の解明について検討を行う。本研究により、糖尿病におけるβ細胞低酸素の病態的意義が明らかになり、β細胞低酸素を標的とした新たな糖尿病治療法開発への応用が期待される。
平成28年度は、①HIF非依存的経路の解析と新規低酸素応答因子の探索を行う。具体的にはキナーゼ活性欠失型AMPKα2や前駆体miRNAを過剰発現させたMIN6細胞を用いてAMPKおよびmiRNAの関与について検討する。またHIF-1βノックダウンMIN6細胞を低酸素に暴露し、核分画蛋白で発現が変動した蛋白を質量分析により同定する。②通常マウスと糖尿病マウスから単離した膵島を培養し、細胞外フラックスアナライザーを用いてミトコンドリア機能の評価および代謝経路のプロファイリングを行う。③GLP-1による低酸素回避シグナル解析（in vitro）を行う。具体的には細胞内cAMPを増加させる薬剤（フォルスコリンなど）やPKA阻害剤（H-89など）が、低酸素あるいは低酸素改善効果に与える影響を検討する。またGLP-1がβ細胞の酸素消費に与える影響について細胞外フラックスアナライザーを用いて検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究代表者は、低酸素が膵β細胞に重要な遺伝子の発現を低下させることを以前に報告した。平成28年度は、まずこれらの遺伝子発現低下にHIF非依存的経路（AMPKなど）の関与の有無を検討した。キナーゼ活性欠失型AMPKα2を過剰発現させたMIN6細胞を作製し、低酸素で低下したβ細胞遺伝子（Pdx1, Neurod1, Slc2a2, Wfs1）の発現を定量的PCRで検討した。その結果、低酸素によるこれらの遺伝子の発現低下は回復しなかった。このことからAMPKシグナルの関与は否定的であった。さらに質量分析による新規低酸素応答因子の同定を試みた。HIF-1βノックダウンMIN6細胞を作製し低酸素に暴露後に、核分画蛋白をSDS-PAGEにて蛋白を展開、銀染色を行った。しかしながら、低酸素暴露により著明に蛋白発現が変化するバンドは認められなかった。低酸素で誘導される既知のHIF-1αの蛋白でさえこの銀染色では検出できなかったため、この方法では検出感度が低く蛋白の同定は困難であると考えられた。次にDNAマイクロアレイを用いて新規低酸素応答因子の同定を試みた。その結果、膵β細胞において著明に発現が誘導される遺伝子を幾つか同定した。現在引き続き膵β細胞機能におけるそれらの遺伝子の役割を検討している。次に低酸素に対するGLP-1のβ細胞防御機構について検討した。その結果、高血糖は膵島の低酸素化に寄与するがGLP-1だけでなくフォルスコリンによっても高血糖による低酸素を回避した。このことからcAMPの関与が強く示唆された。現在、阻害剤を用いて詳細なシグナル経路の解析を行っている。また糖尿病マウスにおけるミトコンドリア機能の評価を行うため、膵島を用いた細胞外フラックスアナライザーによる代謝経路プロファイリングの実験の基礎的検討を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２８年度は、概ね順調に研究を進められたが、糖尿病マウスを用いたβ細胞低酸素の成因解明の検討に関しては進められなかった。平成２９年度はこの研究テーマに関して重点的に検討を行っていく。具体的には細胞外フラックスアナライザーを用いて糖尿病マウス膵島のミトコンドリア機能の評価および代謝経路のプロファイリングを行う。さらに膵組織のレクチン染色あるいはCD31染色で血管量の評価を行う。ローダミンデキストランやマイクロスフィアによって膵島内血流量を測定する。またDNAマイクロアレイにより同定した新規低酸素応答因子について低酸素下における役割について検討する予定である。具体的にはノックダウンあるいは過剰発現MIN6細胞を作製し、低酸素で発現が低下したβ細胞遺伝子の発現が回復するかを検討する。また通常酸素あるいは低酸素下でのインスリン分泌能や細胞死に対する影響を調べる。さらに細胞の低酸素応答（糖代謝変化や血管新生など）について検討を行う。低酸素に対するGLP-1のβ細胞防御機構に関しては、阻害剤を用いた実験を引き続き行うと共に、ピモニダゾールおよびHIF、インスリンおよびミトコンドリア呼吸鎖関連蛋白（COXなど）の免疫組織染色によりGLP-1による低酸素改善効果についてob/obマウスを用いてin vivoで確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
来年度から高額な消耗品の購入により支出が増えることが想定されたため当該年度の予算を次年度に繰り越すこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
肥満糖尿病モデルマウスの大量購入および細胞外フレックスアナライザーに使用する消耗品に繰り越し予算を使用する予定である。
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