| 研究課題/領域番号 |
16K09768
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
中村 二郎 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40283444)
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| 研究分担者 |
加藤 宏一 愛知学院大学, 薬学部, 教授 (40319322)
姫野 龍仁 愛知医科大学, 医学部, 助教 (60753762)
神谷 英紀 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (70542679)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 糖尿病多発神経障害 / 皮膚幹細胞 / Nestin陽性神経前駆細胞 / シュワン細胞 / 細胞移植療法 / S100b / GFAP / NGF |
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| 研究実績の概要 |
糖尿病多発神経障害（DPN）の初期病理像として末梢神経系の神経終末におけるダイナミックな変性・再生が注目されているが、その機序の詳細は不明である。神経終末は神経筋接合部や皮膚感覚器において、それぞれパチニ小体などの特異な形態をグリア細胞と共に構築することで、各々の固有機能を発揮している。昨年度研究では、神経終末グリア細胞のDPNにおける変化を解明するため、ストレプトゾトシン誘発1型糖尿病モデルマウスを作成し電気生理学的検査を行い、加えて、皮膚由来神経堤幹細胞より分化誘導したシュワン系細胞の確立を行った。いかに、方法と結果を示す。
【方法】1）5週齢雄性EGFP-C57BL/6Jより皮膚線維芽細胞を初代培養・球状凝集化し、sDSCを作製。Nestin陽性神経前駆細胞（sDSC-NC）を誘導。2）8週齢C57BL/6Jを用い、STZ糖尿病マウスを作成。3）ストレプトゾトシン投与3カ月後、糖尿病マウスと正常マウスの片側下肢筋に1）で得られたsDSC-NCsを各肢30000 cellsを移植し、対側には生食を投与。4）治療前および治療4週後に下肢神経伝導速度検査を施行。5）移植治療4週後、下肢組織における移植細胞の生着確認し、免疫組織学的解析、ならびにRT-PCRにて非移植組織と移植組織の各サイトカインmRNA発現を定量。【結果】1）移植後4週後において下肢組織に多数のGFP陽性細胞(sDSC-NC)の生着確認、腫瘍形成は認めない。2）糖尿病状態では神経伝導速度が低下、sDSC-NC移植はこの低下を有意に改善させた。3) 移植細胞生着組織にNGFとPGES1 mRNA発現上昇を認めた。4）sDSC-NCは、S100bやGFAPを発現しシュワン様細胞に一部分化していた。その他、β3-tublin、αSMA、S100A4も認め、皮膚由来幹細胞は、ヘテロな細胞集団への分化を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の糖尿病神経障害モデルマウスでの、神経終末病理変化と解析は、本年度の課題とする。
現在、大学院生2名と実験助手1名と研究継続しており、残り2年間に、DPNの病理学的解明と細胞移植療法の治療機序解明により、糖尿病神経障害のみならず、糖尿病合併症解明に繋がる治療ターゲットの発見に向けた研究に邁進できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
DPNにおける神経終末グリア細胞群の機能不全を解明する
ストレプトゾトシン誘発1型糖尿病モデルマウスを用い、4週毎に足底皮膚および下肢骨格筋（ヒラメ筋）を採取し、HE染色、免疫染色（PGP9.5, GAP43, peripherin, S100, glutamine synthetase, GFAP, MBP, α-Bungarotoxin等）、および透過型電子顕微鏡検査 を用い、神経終末グリア細胞群の定量的および定性的評価を行う。また、研究が当初計画通りに進まない時に備え、採取組織の一部は、Laser microdissection法により神経終末グリア細胞のmRNAを回収し、microarrayにより、網羅的に細胞状態の変化を評価する。
次に、Schwann cell precursor、immature Schwann cell、シュワン細胞の3種のシュワン系細胞を、それぞれ、20週齢以降の野生型マウスの下腿筋肉内および足底皮下へ移植する。移植後、8週毎に24週までヒラメ筋および足底を回収し、GFPおよびS100b等のマーカーによる共免疫染色を行い、生着した移植細胞の分布・形態を評価する。
以上を行い、糖尿病神経障害の神経終末病理変化とその機能改善経過を評価、機序解明の原因検索を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度助成金はおおよそ計画通りであったが、その一部は研究室に既存の消耗品や実験器具を使うことにより、科研費の使用を抑制できた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今後の、研究課題として組織の蛍光染色やRT-PCR解析が必要となり、抗体やプライマー、消耗品等多くの物品購入が必要となる。今年度研究費が不足するため昨年度の余剰金を使用し補う。
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