| 研究課題/領域番号 |
16K09825
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 教授 (40161913)
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| 研究分担者 |
高木 明 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 准教授 (30135371)
松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | アンチトロンビン・レジスタンス（ATR） / プロトロンビン / 遺伝子異常 / トロンビン / アンチトロンビン / Na+結合領域 / ジーンタ一ゲティング / R593Lノックインマウス |
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| 研究実績の概要 |
我々は新しい血栓性素因・アンチトロンビン・レシスタンス（ATR）を示すプロトロンビン異常症（prothrombjn Yukuhashi, p.R596）の遺伝子異常（F2 c.1787G>T）を報告し（N Engl J Med. 2012）、さらに血漿検体によるATR検出検査法を確立し、これを用いて異なる変異（F2 c.1787G>A, p.R596Q, prothrombjn Belgrade: J Thromb Haemost. 2013）でのATRも同定している。今年度は血漿検体を用いたATR検出・臨床検査法により新たなATR症例を同定し本邦2例目のprothrombjn Belgrade症例を報告した。組換え技術を用いてトロンビンのアンチトロンビン結合部・Na+結合領域を構成するアミノ酸（596H, 599K, 540T, 541R, 592E）に一塩基置換によるミスセンス変異を導入し、種々プロトロンビン変異体の安定発現株を作製したところ、各プロトロンビンの変異体は野生型と同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明したが、多くの変異体でのプロトロンビン凝固活性も減弱していた。また、R593L(ヒトR596Lに相当)ノックインマウスは、CAG-Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、LoxP配列を含むNeo耐性遺伝子を除去することに成功し、完全なR593Lノックインマウス(R593Lヘテロマウス)の樹立に成功し、R593Lへテロマウス同士の高配でのホモ/ヘテロ/野生型の出生比率はおおよそ1：2：1であった。ホモ/ヘテロ/野生型マウスの血漿検体を解析したところ、ホモ＞ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
先の研究成果として確立した血漿検体を用いた迅速ATR検出スクリーニング法を用い、未だ原因の特定に至っていない遺伝性血栓症症例における新たなATR血栓性素因患者を検出・同定した。Na+結合領域を構成するアミノ酸(596R,599K,540T,541R,592E)に一塩基置換で生ずるミスセンス変異体発現ベクターを組換え技術にて作製したところ、各プロトロンビン変異体は野生型プロトロンビンと同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明した。先の研究成果として得られたジーンタ一ゲティング手法により作製したYukuhashi変異(R593Lプロトロンビン:ヒト分子の596Rはマウス分子59罧に相当)のキメラマウス父配により、ヘテロマウス(R593Lヘテロマウステの作製に成功し、各血漿検体を解析したところ、ホモ＞ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、未だ原因特定に至っていない遺伝性血栓症におけるATR血栓性素因の有無について、血漿検体を用いてのATR検出法による検索解析を継続するとともに、ATR症例においてはその原因遺伝子変異の同定解析も行い、新たなATR遺伝子変異の同定を含めた血栓症発症の分子病態解明研究を継続する。また、トロンビン分子のNa+結合領域に位置しTAT複合体でのAT分子の264Eとの水素結合形成するプロトロンビン599Kならびに水分子を介してAT分子の264Eと結合する540T,541R,592Eにおいて、一塩基置換で生ずるミスセンス変異体をそれぞれ作製し、ATR検査やプロトロンビン活性への影響を検討、ならびに各組換え体由来トロンビンのTAT形成能を解析し、ATRを不す変異体の同定解析を継続して行う。さらに、Yukuhas㎞変異ヘテロマウス(R593Lヘテロマウス)を用い、その血漿検体でのATRを検証するとともに、種々血栓誘発刺激(FeCl3や電気)による下大静脈血栓形成、組織因子あるいは高分子ポリリン酸による肺塞栓形成)による血栓形成動態のin vivo解析を行い、野生型との比較検討解析を行う。また、種々薬剤（未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、フォンダパリヌクス、Xa阻害薬、IIa阻害薬）の抗凝固薬効効果判定における変異マウスの血栓性素因モデルマウスとしての有用性を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H29年度にわずかに(1,842円)残額が発生してしまった。
(使用計画)
H29年度にわずかに残った1,842円は、H30年度の1,100,000円と合算して使用予定である。
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