先天性角化不全症の新規原因遺伝子変異の同定と新規治療法の開発

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09832
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 山口 博樹 日本医科大学, 医学部, 准教授 (90297937)
• 研究分担者: 猪口 孝一 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (10203267) ; 三宅 弘一 日本医科大学, 医学部, 准教授 (90267211)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 先天性角化不全症 / TEP1遺伝子 / ACD遺伝子 / 遺伝子変異

研究実績の概要

先天性角化不全症(DKC)は特徴的身体的所見を伴う先天性の骨髄不全症である。DKCはテロメアを制御する遺伝子群の異常によって発症をすると考えられているが、その約40%の症例は原因遺伝子が同定されていないことが問題である。研究代表者の山口博樹は原因遺伝子が同定されていないDKC症例に対して次世代シークエンサーを用いて新規原因遺伝子の探索を行った。その結果としてテロメラーゼ複合体遺伝子群の１つであるTEP1、Shelterin複合体遺伝子群の１つであるACD(TPP1)、DNAヘリカーゼ遺伝子群であるBLMとPIF1、WRNとRECQL4に新規の遺伝子変異を同定した。本研究はこれら新規に発見された遺伝子変異がどのようにして細胞内のテロメア短縮補正を破綻させDKCの病態に関与しているかを解明することが目的である。
今年度は
1. オリゴ合成にてwild typeのTEP1、ACD、DKC症例で発見されたそれぞれの遺伝子変異を作成し、各遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを作成した。
2. 各遺伝子変異の機能解析を行うにあたり、knockdown 細胞株の作成を試みた。HAP1細胞株は山中因子により産生された一倍体の細胞株であり、CRISPER Cas9システムによるknockdown に適した細胞株である。HAP1細胞株にCEISPER Cas9システムを用いてTEP1、ACD遺伝子をknockdownしたHAP1細胞株を作成したが、抗TEP1抗体、抗ACD抗体でウエスタンブロットを行ったところ蛋白レベルでのknockdownが確認されず、現在難渋している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

HAP1細胞株にCEISPER Cas9システムを用いてTEP1、ACD遺伝子をknockdownしたHAP1細胞株を作成しているが、これまでに3種類の遺伝子改変をおこなったがいずれもTEP1、ACD遺伝子をknockdownすることが出来ていない。現在別のCEISPER Cas9システムを用いてknockdownを行っている。

今後の研究の推進方策

今後の方針としては、TEP1、ACD遺伝子をknockdownしたHAP1細胞株を作成に成功すれば、各遺伝子変異を発現するレトロウイルスベクターやTEP1、ACDを認識する抗体などの準備はできているためTEP1遺伝子変異やACD遺伝子変異がどのようにして細胞内のテロメア短縮補正を破綻させDKCの病態に関与しているかを解明することができると考えている。

次年度使用額が生じた理由

TRP1やACDのknockアウト細胞の作成がなかなかうまく行かなかったため実験消耗品を一部購入する必要がなかった。

次年度使用額の使用計画

今後TRP1やACDのknockアウト細胞の作成に成功した後に機能解析で使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical application of Capture-based Target Sequencing for Inherited Bone Marrow Failure Syndromes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Muramatsu H, Okuno Y, Yoshida K, Shiraishi Y, Doisaki S, Narita A, Sakaguchi H, Kawashima N, Wang X, Xu Y, Chiba K, Tanaka H, Hama A, Sanada M, Takahashi Y, Kanno H, Yamaguchi H, Ohga S, Manabe A, Harigae H, Kunishima S, Ishii E, Kobayashi M, Koike K, Watanabe K, Ito E, Takata M, Yabe M, Ogawa S, Miyano S, Kojima S.
  • 雑誌名: Genetics in Medicine. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1038/gim.2016.197.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 骨髄不全症におけるテロメア制御異常 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口博樹
  • 雑誌名: 血液フロンティア 巻: 27 ページ: 5-9
• [雑誌論文] Hoyeraal-Hreidarsson syndrome in a patient with novel compound heterozygous RTEL1 gene mutations. (2016)
  • 著者名/発表者名: Moriya K, Suzuki T, Watanabe Y, Saito-Nanjo Y, Niizuma H, Onuma M, Rikiishi T, Kakuta F, Abukawa D, Yamaguchi H, Sasahara1 Y, Kure S.
  • 雑誌名: Pediatric Blood &Cancer. 巻: 63 ページ: 1683-1684
  • DOI: 10.1002/pbc.26030.
  • 査読あり