血栓性リスクとなるプロテインS K196E異常症に関する研究

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09834
• 研究機関: 国立研究開発法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 宮田 敏行 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 非常勤研究員 (90183970)
• 研究分担者: 吉松 淳 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 部長 (20221674) ; 秋山 正志 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (30298179) ; 丸山 慶子 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 流動研究員 (30712624) ; 小亀 浩市 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40270730)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 血栓性素因 / 凝固制御因子 / 静脈血栓症、 / 変異体 / プロテインS

研究実績の概要

日本人にだけに見られるプロテインS K196E（PS-K196E）の性質
私達は抗血栓因子であるADAMTS13を動物細胞で大量に発現させ、結晶構造解析を行った経験を持つ（Akiyama et al, PNAS, 2009）。この時に用いた動物細胞の発現系を用いて、野生型および変異型プロテインS K196E（PS-K196E）を発現させ精製した。CHO Lec細胞にHisタグ付き野生型および変異型PS発現ベクターをリポフェクション法にて導入し、安定発現細胞株を樹立した。ローラーボトルを用いて大量培養を行い、培地をNi-NTAアフィニティーカラムに通しHisタグ付きPSタンパク質を精製した。次いで、TEVプロテアーゼでHisタグを除去した後、陰イオン交換カラムを用いて、Gla化された組換えPSを精製した。STA Clot Protein S kitを用いて、精製PS標品の活性化プロテインC（APC）のコファクター活性（APC活性増強作用）を調べたところ、変異型PSは野生型PSに比べ約46％に活性が低下していた。次に、APC-FVa inactivation assayにてAPCコファクター活性を評価したところ、FVa活性が50%に低下する際の変異型PSは野生型PSの約2倍量が必要であった。この結果から、PS-K196Eが静脈血栓塞栓症のリスクになるのは、変異体のAPCコファクター活性の低下が考えられた。
ピル服用者のPS K196E変異および先天性凝固因子欠乏症
国立循環器病研究センター周産期婦人科との共同研究で、ピル服用者の凝固制御因子の調査を行っている。これまでに、約400人の登録が終了した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

プロテインS K196E（PS-K196E）の性質に関する研究は、タンパク質の発現系を確立し、これを用いて正常PSおよび異常PSを精製純化後、酵素学的性質を検討した。その結果、PS-K196Eは活性化プロテインCの補酵素活性が約半分にまで低下していた。以前私達は、地域一般住民（1862人）にPS-K196Eヘテロ接合体者（34人）を認め、その血中PS抗凝固活性は、正常PSを有する人（1828人）に比べ、約16％低下することを報告した（Kimura et al, J Thromb Haemost, 4, 2010-92013, 2006）。今回のPS-K196E変異体の酵素学的性質（活性化プロテインCの補酵素活性の低下）は、ヒトを対象にした研究結果を強く支持している。
ピル服用者を対象とする研究は、約400人の登録が終了した。ピル服用前後のプロテインC、プロテインS、アンチトロンビンの活性と抗原量の測定を開始している。また、服薬後の血栓症の有無を追跡している。こちらの研究もほぼ順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

プロテインS K196E（PS-K196E）の性質に関する研究は、確認のための実験を行った上で、データを取りまとめて原著論文として成果を発表したい。ピル服用者を対象とする研究は、登録した約400人のピル服用前後のプロテインC、プロテインS、アンチトロンビンの活性と抗原量の変化を調べているところである。服用前に測定した凝固制御因子の活性が低下している症例は、DNAシークエンス法により遺伝子変異があるかどうかを調べる。引き続き、血栓症発症の有無を追跡調査する。

次年度使用額が生じた理由

国立循環器病研究センター周産期婦人科と共同で、ピル服用者の凝固制御因子の調査を行っている。平成28年度は、約400人を登録するところまで研究を進める事ができた。筆頭著者として総説１報と原著論文１報を英文で発表した。これらに多くの時間を費やした。

次年度使用額の使用計画

平成29年度は収集した試料（約400人）の凝固制御因子の測定などを行う計画である。また、ピル服用前に測定した凝固制御因子の活性が低下している症例は、先天性欠乏症の疑いがあると考えられるので、DNAシークエンス法により遺伝子変異があるかどうかを調べる予定である。研究費を遺伝子解析などの試薬代に有効に使用したい。

研究成果

• [雑誌論文] Cardiovascular events occur independently of high on-aspirin platelet reactivity and residual COX-1 activity in stable cardiovascular patients (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagatsuka K, Miyata S, Kada A, Kawamura A, Nakagawara J, Furui E, Takiuchi S, Taomoto K, Kario K, Uchiyama S, Saito K, Nagao T, Kitagawa K, Hosomi N, Tanaka K, Kaikita K, Katayama Y, Abumiya T, Nakane H, Wada H, Hattori A, Kimura K, Isshiki T, Nishikawa M, Yamawaki T, Yonemoto N, Okada H, Ogawa H, Minematsu K, Miyata T
  • 雑誌名: Thromb Haemost 巻: 116 ページ: 356-368
  • DOI: 10.1160/TH15-11-0864
  • 査読あり
• [雑誌論文] No association between dysplasminogenemia with p.Ala620Thr mutation and atypical hemolytic uremic syndrome (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyata T, Uchida Y, Yoshida Y, Kato H, Matsumoto M, Kokame K, Fujimura Y, Nangaku M
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 104 ページ: 223-227
  • DOI: 10.1007/s12185-016-2021-3
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Complete remission of thrombotic microangiopathy after treatment with eculizumab in a patient with non-Shiga toxin-associated bacterial enteritis: A case report (2016)
  • 著者名/発表者名: Omura T, Watanabe E, Otsuka Y, Yoshida Y, Kato H, Nangaku M, Miyata T, Oda S
  • 雑誌名: Medicine (Baltimore) 巻: 95 ページ: e4104
  • DOI: 10.1097/MD.0000000000004104
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Influence of a rotational speed modulation system used with an implantable continuous-flow left ventricular assist device (EVAHEART) on von Willebrand factor dynamics (2016)
  • 著者名/発表者名: Naito N, Mizuno T, Nishimura T, Kishimoto S, Takewa Y, Eura Y, Kokame K, Miyata T, Date K, Umeki A, Ando M, Ono M, Tatsumi E
  • 雑誌名: Artif Organs 巻: 40 ページ: 877-883
  • DOI: 10.1111/aor.12666
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Thrombophilia in East Asian countries: are there any genetic differences in these countries? Review (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyata T, Maruyama K, Banno F, Neki R
  • 雑誌名: Thromb J 巻: 14 ページ: 123-128
  • DOI: 10.1186/s12959-016-0109-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Disease recurrence after early discontinuation of eculizumab in a patient with atypical hemolytic uremic syndrome with complement C3 I1157T mutation (2016)
  • 著者名/発表者名: Toyoda H, Wada H, Miyata T, Amano K, Kihira K, Iwamoto S, Hirayama M, Komada Y
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 38 ページ: e137-139
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000000505
  • 査読あり
• [雑誌論文] 不育症と先天性血栓性素因 (2016)
  • 著者名/発表者名: 根木玲子、宮田敏行
  • 雑誌名: 日本血栓止血学会誌 巻: 27 ページ: 339-348
  • DOI: http://doi.org/10.2491/jjsth.27.339
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] シンポジウム７「心房細動と脳卒中を考える」、「新たな抗凝固薬の開発」 (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行
  • 学会等名: 第42回日本脳卒中学会学術集会
  • 発表場所: 大阪市、大阪府
  • 年月日: 2017-03-16 – 2017-03-19
• [学会発表] “Differences in Prothrombotic States among Races/Regions”, Session 129: Antithrombotic Therapy Specific to Races/Regions (in the NOAC Era) (2017)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: International Stroke Conference 2017
  • 発表場所: Houston, USA
  • 年月日: 2017-02-22 – 2017-02-24
• [学会発表] Thrombophilia in East Asian Countries. Are there any genetic differences in these countries? (2016)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: The 9th Congress of the Asian-Pacific Society of Thrombosis and Hemostasis
  • 発表場所: Taipei, Taiwan
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-09
• [学会発表] No association between dysplasminogenemia with p.Ala620Thr mutation and atypical hemolytic uremic syndrome (2016)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Miyata, Yumiko Uchida, Yoko Yoshida, Hideki Kato, Masanori Matsumoto, Koichi Kokame, Yoshihiro Fujimura, Masaomi Nangaku
  • 学会等名: XXVIth International Complement Workshop
  • 発表場所: 金沢市
  • 年月日: 2016-09-04 – 2016-09-08
• [学会発表] Plasminogen Tochigi mice with severely reduced plasminogen activity exhibit phenotypes similar to wild-type mice under experimental thrombotic conditions (2016)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Miyata, Yuko Tashima, Fumiaki Banno, Toshiyuki Kita, Yasuyuki Matsuda, Hiroji Yanamoto
  • 学会等名: Gordon Research Conference on Hemostasis
  • 発表場所: Stowe, Vermont, USA
  • 年月日: 2016-07-24 – 2016-07-26
• [学会発表] 非典型溶血性尿毒症症候群患者におけるプラスミノーゲン A620T変異 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行、内田裕美子、藤村吉博、吉田瑤子、加藤秀樹、南学正臣
  • 学会等名: 第38回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 奈良市
  • 年月日: 2016-06-16 – 2016-06-18
• [学会発表] 血栓形成メカニズムの最新のトピックス、「静脈血栓症の発症メカニズム」 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行
  • 学会等名: 第41回日本脳卒中学会総会
  • 発表場所: 札幌市、北海道
  • 年月日: 2016-04-14 – 2016-04-16