次世代シークエンスによる再発難治性急性白血病のゲノム構造の解析

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09836
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 小野澤 真弘 北海道大学, 大学病院, 助教 (70455632)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ゲノム損傷

研究実績の概要

細胞株を用い、CRISPRにより導入した部位特異的な遺伝子切断がどのように修復されるかを検討した。CRISPRによる切断部位をPCR増幅し、アンプリコンをディープシークエンスにより解析した。多くは短い挿入欠失(Short InDel)で修復されたが、一部は長い(>50bp)挿入や欠失により修復されていた。挿入配列は他の染色体部位の配列が挿入されたり、テロメア配列(TTAGGG)nが挿入される場合があった。
抗がん剤や放射線照射によるゲノム損傷を網羅的に解析するため、ヒト白血病細胞株をEtopocide、放射線照射で処理した上で、限界希釈により細胞を撒き、これらの処置を生き延びた娘細胞を１細胞由来のクローンとして樹立し、親株とともに全ゲノムシークエンス(WGS)を行った。構造変異、Short InDelに注目し、娘細胞特異的な変異を検討した。また、テロメラーゼによるゲノム修復が(TTAGGG)nの挿入配列で起きることから、リファレンスゲノムにはない(TTAGGG)n配列挿入は、腫瘍の体細胞変異である可能性があり、その定量値はゲノム損傷修復を繰り返した後の再発難治性白血病で高い可能性がある。
急性骨髄性白血病においてFlt3-ITD変異は予後不良のマーカーである。Flt3-ITDは白血病発症の後期に入る変異と考えられており、1症例中に複数の種類のFlt3-ITDクローンが検出されることがある。臨床検体で、Flt3-ITD変異部位をPCR増幅し、ディープシークエンスを行った。各症例から複数のFlt3-ITDが検出されるとともに、複数の欠失変異クローンが検出された。これは同部位が繰り返しゲノム損傷を受けやすい部位で、個々の細胞で別々の修復が起きていることを示唆しており、"Flt3バリエーション"はゲノム損傷の代理マーカーとなる可能性がある。

研究成果

• [雑誌論文] Quantitative detection of IKZF1 deletion by digital PCR in patients with acute lymphoblastic leukemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hashiguchi J, Onozawa M, Okada K, Amano T, Hatanaka KC, Nishihara H, Sato N, Teshima T.
  • 雑誌名: Int J Lab Hematol. 巻: 41 ページ: e38-e40
  • DOI: 10.1111/ijlh.12945.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a Fluorescence in Situ Hybridization Probe for Detecting IKZF1 Deletion Mutations in Patients with Acute Lymphoblastic Leukemia. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hashiguchi J, Onozawa M, Oguri S, Fujisawa S, Tsuji M, Okada K, Nakagawa M, Hashimoto D, Kahata K, Kondo T, Shimizu C, Teshima T.
  • 雑誌名: J Mol Diagn. 巻: 20 ページ: 446-454
  • DOI: 10.1016/j.jmoldx.2018.02.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Wilms Tumor 1 Expression at Diagnosis Correlates With Genetic Abnormalities and Polymorphism But Is Not Independently Prognostic in Acute Myelogenous Leukemia: A Hokkaido Leukemia Net Study. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hidaka D, Onozawa , et al.
  • 雑誌名: Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 巻: 18 ページ: e469-e479
  • DOI: 10.1016/j.clml.2018.07.291.
  • 査読あり
• [学会発表] WT1 expression at onset of AML correlated collaborative cytogenetic abnormality and WT1 SNP status (2018)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Onozawa, et al.
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会