転写ネットワーク解析によるRunx1の造血制御メカニズムの解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09857
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 忠垣 憲次郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30416268)
• 研究分担者: 奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 転写因子 / RUNX1 / 造血幹細胞 / 標的遺伝子

研究実績の概要

Runx1による造血幹細胞の分化プロセスの機構の解明を目的として、Runx1の新規候補標的遺伝子の機能解析を行った。ES細胞分化（胚様体形成）モデルの網羅的遺伝子解析により得られた種々のRunx1依存性分子の中で、発現変化が顕著であった３種を新規候補標的遺伝子として選定し、以下の検討を行った。
（１）３種の候補標的遺伝子のプロモーター領域についてin silico解析でRunx1結合部位の存在の有無を調べた結果、それぞれに存在することが確認された。そこで、Runx1による転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにて検討した。候補標的遺伝子のプロモーター領域とされるRunx1結合部位を含む転写開始点上流に位置するDNA断片をクローニンングし、各遺伝子プロモーター含有ルシフェラーゼアッセイベクターを作成した。次いで、24 well plateに播種したHeLa細胞に対し、リポフェクション法によりRunx1発現プラスミドと各ルシフェラーゼベクターを導入し、48時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。Runx1により３種の候補標的遺伝子の転写は正に活性化された。
（２）次に、候補標的遺伝子のプロモーター領域のRunx1結合部位付近にRunx1が結合しているかを確認するために、クロマチン免疫沈降法を行った。ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞に対し、Runx1抗体で免疫沈降させたDNA断片を鋳型にリアルタイムPCRにて相対定量比較を行った。その結果、３種のうち２種の候補標的遺伝子でコントロール領域と比較してRunx1結合部位付近で顕著なRunx1の結合を認めた。
以上より、３種の候補標的遺伝子はメカニズムの一つとしてRunx1が各遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を制御する可能性が示唆されたことからRunx1の新規標的遺伝子である可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画通り選定したRunx1の３種の候補標的遺伝子について、クロマチン免疫沈降法とレポーターアッセイを行い、これらがRunx1の新規標的遺伝子であることが示唆される結果が得られたことから、ここまでのところ順調に計画が進行しているものと考えている。また、３種の候補標的遺伝子のうち、Runx1による発現作用を１種が正に、２種が負に制御されているものとして見出せたことは、これら候補標的遺伝子が今後Runx1による造血幹細胞の分化プロセス機構を詳細に解明していくうえで役に立つ遺伝子であると期待している。

今後の研究の推進方策

今後は、まずRunx1による３種の候補標的遺伝子の転写作用がどのような生化学的特性を持つのか検討を進める。Runx1結合部位に結合しない変異型Runx1とRunx1結合部位に変異を施した変異型ルシフェラーゼベクターを利用し、Runx1作用が直接的か他の分子を介した間接的かを検討し、Runx1転写因子の候補遺伝子プロモーター領域に対する作用の評価を確定する。また、間接的な場合この転写作用に影響を与える因子はどのようなものかなどについて検討し、近傍に結合する他の造血関連転写因子群との機能協調や転写ネットワークの解明を試みたい。同時に候補標的遺伝子の発現作用についてタンパクレベルで検討したい。さらに、Runx1による標的がどのような生理的意義を持つのかについての解明も試みたい。まずはES細胞と候補標的遺伝子ノックダウンの系を用いてアプローチを試みたい。

研究成果

• [雑誌論文] Systematic protein-protein interaction mapping for clinically relevant human GPCRs. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sokolina K, Kittanakom S, Snider J, Kotlyar M, Maurice P, Gandia J, Benleulmi-Chaachoua A, Tadagaki K, Oishi A, Wong V, Malty RH, Deineko V, Aoki H, Amin S, Yao Z, Morato X, Otasek D, Kobayashi H, Menendez J, Auerbach D, Angers S, Przulj N, Bouvier M, Babu M, Ciruela F, Jockers R, Jurisica I, Stagljar I.
  • 雑誌名: Molecular Systems Biology 巻: 13(3) ページ: -
  • DOI: 10.15252/msb.20167430.
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] RUNX1によるTRAIL遺伝子の転写制御機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉田達士、山崎健太、忠垣憲次郎、桒原康道、酒井敏行、奥田司
  • 学会等名: 第21回造血器腫瘍研究会
  • 発表場所: 熊本大学（熊本市）
  • 年月日: 2017-02-17
• [学会発表] 白血病関連転写因子の制御法の開発と白血病治療に向けた応用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 吉田達士、山崎健太、忠垣憲次郎、桒原康道、奥田司
  • 学会等名: 平成28年度第6回4大学連携研究フォーラム
  • 発表場所: 京都薬科大学（京都市）
  • 年月日: 2016-12-07
• [学会発表] RUNX1/AML1はTRAILの転写制御に関与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 吉田達士、山崎健太、忠垣憲次郎、桒原康通、酒井敏行、奥田司
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2016-12-02
• [学会発表] A candidate target gene of RUNX1/AML1 transcription factor. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tatsushi Yoshida, Kenjiro Tadagaki, Kenta Yamasaki, Yasumichi Kuwahara, Toshiyuki Sakai, Tsukasa Okuda.
  • 学会等名: 第78回日本血液学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
  • 年月日: 2016-10-14
• [学会発表] A natural inhibitor of Runt-related Transcription Factor 1 / Acute Myeloid Leukemia 1 (RUNX1/AML1). (2016)
  • 著者名/発表者名: Tatsushi Yoshida, Kenta Yamasaki, Kenjiro Tadagaki, Yasumichi Kuwahara, Tsukasa Okuda.
  • 学会等名: 第89回日本生化学会
  • 発表場所: 東北大学（仙台市）
  • 年月日: 2016-09-26