転写ネットワーク解析によるRunx1の造血制御メカニズムの解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09857
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 忠垣 憲次郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30416268)
• 研究分担者: 奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 転写因子 / RUNX1 / 標的遺伝子 / 造血幹細胞

研究実績の概要

当該研究ではこれまでに3種の候補標的遺伝子群を特定している。そこで本年度はこれら３種の候補標的遺伝子の転写がどのようなメカニズムによってRUNX1による制御を受けるのか検討を進めた。コンセンサス配列に結合しない一連の変異型RUNX1の発現ベクターと、RUNX1結合部位に変異を施した変異型ルシフェラーゼベクターを利用し、RUNX1転写因子の候補遺伝子プロモーター領域に対する作用について解析した。
まず３種の候補標的遺伝子それぞれのプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を導入することによってレポーターコンストラクトを作製した。また、RUNX1結合配列に変異を導入してRUNX1が結合できない変異体プロモーターを作製し、これら変異型プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋いだレポーターコンストラクトも作製した。これらのプラスミドと上述のRUNX1変異体とのさまざまな組み合わせを用いて、ヒト血球系培養細胞中の転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにて検討した。
その結果、３種の候補標的遺伝子のプロモーター領域はRUNX1によっていずれも正方向に活性化された。重要なことに、RUNX1コンセンサス部位に結合しない変異型RUNX1を用いて同様にルシフェラーゼアッセイを行うと、３種とも候補標的遺伝子の転写は活性化されなかった。くわえて転写活性化ドメインを欠くRUNX1変異体をもちいて同様の検討を行なったが、ここでもプロモーターの活性化は観察されなかった。これらのことから、この3種の遺伝子群はいずれもRUNX1の転写標的であるものと考えられた。
現在、これらのプロモーター配列のRUNX1コンセンサス配列変異体のコンストラクトを用いて、こうした転写調節がRUNX1による直接的なものか、あるいは他の転写因子群との協調の上に成立しているものなのか検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでの探索によって特定した３種の候補標的遺伝子群について、じっさいにRUNX1による転写制御を受けているのかどうか各種RUNX1変異体を用いたレポーターアッセイを用いて解析した。その結果、いずれもRUNX1の転写標的であるものと考えられた。今後はこの作用が直接この転写作用に影響を与える因子かどうかを検討してゆく。これら候補標的遺伝子３種がどのようにRUNX1機能と係るか解析することによって、造血幹細胞制御における重要な知見が得られるものと期待している。

今後の研究の推進方策

標的遺伝子群のプロモーター配列中のRUNX1コンセンサス配列に変異を入れたコンストラクトを用いて、今回見出された転写調節がRUNX1による直接的なものか、あるいは他の転写因子群との協調の上に成立しているものなのか検討を進めてゆく。もしもRUNX1作用が他の分子を介した間接的なものである可能性が示唆された場合は、この転写作用に影響を与える因子がどのような分子なのかなどについて検討を開始し、近傍に結合する他の造血関連転写因子群との機能協調や転写ネットワークの解明を試みたい。同時に候補標的遺伝子の発現状況について、RNAレベル、タンパクレベルで検討したい。さらに、これらのRUNX1標的がどのような生理作用を持つのかについての解明も試みたい。まずはES細胞と候補標的遺伝子ノックダウン系を用いて、細胞の分化能力及び増殖能力を評価するコロニー形成法で手がかりを掴みたい。

研究成果

• [雑誌論文] The orphan GPR50 receptor promotes constitutive TGFβ receptor signaling and protects against cancer development. (2018)
  • 著者名/発表者名: Wojciech S, Ahmad R, Belaid-Choucair Z, Journe AS, Gallet S, Dam J, Daulat A, Ndiaye-Lobry D, Lahuna O, Karamitri A, Guillaume JL, Do Cruzeiro M, Guillonneau F, Saade A, Clement N, Courivaud T, Kaabi N, Tadagaki K, Delagrange P, Prevot V, Hermine O, Prunier C, Jockers R.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 (1) ページ: 1216
  • DOI: 10.1038/s41467-018-03609-x
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Importance of the second extracellular loop for melatonin MT1 receptor function and absence of melatonin binding in GPR50. (2017)
  • 著者名/発表者名: Clement N, Renault N, Guillaume JL, Cecon E, Journe AS, Laurent X, Tadagaki K, Coge F, Gohier A, Delagrange P, Chavatte P, Jockers R.
  • 雑誌名: British Journal of Pharmacology 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/bph.14029
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] クロマチンリモデリング因子SNF5と細胞の腫瘍化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 桒原康道、近藤則子、忠垣憲次郎、山崎健太、吉田達士、奥田司
  • 学会等名: 第２２回造血器腫瘍研究会
• [学会発表] RUNX1/AML1転写因子の新規候補標的遺伝子の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 忠垣憲次郎、山崎健太、桒原康道、吉田達士、奥田司
  • 学会等名: 第６４回日本生化学会近畿支部例会
• [学会発表] An array-based approach for novel RUNX1(AML1)-target genes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kenjiro Tadagaki, Yasumichi Kuwahara, Tatsushi Yoshida, Tsukasa Okuda.
  • 学会等名: 第７６回日本癌学会
• [学会発表] Candidate target genes of hematopoietic transcription factor RUNX1 (AML1). (2017)
  • 著者名/発表者名: Kenjiro Tadagaki, Kenta Yamasaki, Yasumichi Kuwahara, Tatsushi Yoshida, Tsukasa Okuda.
  • 学会等名: 第７９回日本血液学会
• [学会発表] 白血病由来RUNX1遺伝子変異体における機能的異常の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉田達士、山崎健太、忠垣憲次郎、桒原康道、近藤則子、奥田司
  • 学会等名: 平成２９年度第７回４大学連携研究フォーラム
• [学会発表] Mechanism of recruitment of SWI/SNF complex via interaction between SNF5 and transcription factor. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yasumichi Kuwahara, Kenta Yamasaki, Kenjiro Tadagaki, Tatsushi Yoshida, Tsukasa Okuda.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会