| 研究課題/領域番号 |
16K09947
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
竹村 弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (80301597)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | L-システイン / カルバペネム薬 / 失活 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、平成25-27年度に科研費を受けた研究（基盤研究C [課題番号25461525]）及び平成28年度からの本研究で、培養上清中のヒト細胞由来のL-cysteine（Cys）はカルバペネム薬であるIPMの抗菌活性を濃度依存的に失活すること、アミノ酸不含の培養液ではCysは検出されないこと、ウシ胎児血清はIPMの失活効果を減弱することを解明し、Cysは培地成分のL-cystine（LC）を細胞が還元することで新生されることなどを明らかにした。
昨年度の研究で、細菌由来のカルバペネム分解酵素の検出法であるCIM testを応用した方法で、Cysは400μMで十分にIPMを失活するが、血清タンパク質存在下では、IPM失活効果を示さないことが判った。そこで平成30年度は、抗菌薬のMIC測定法である微量液体希釈法を応用し、より簡便かつ定量的に抗菌薬に対するCysの効果を評価する系の確立を試みた。すなわちCys 400μM添加培地で従来のMIC法と同様にIPMの大腸菌に対する抗菌活性を評価し、Cys不含の培地の結果と比較検討した。培地としてミュラーヒントン液体培地（MHB）を用いた場合、CysによるIPMの失活効果は観られなかったが、MHBの濃度を1/2、1/4に希釈した場合、MICは各々4倍、64倍に上昇し、CysによるIPMの失活効果が観られた。このことから、CysがMHBに含まれるタンパク質に結合して失活したことが予想されたため、培地をRPMI1640に変えて評価したところ、添加するCys濃度に依存してIPMの失活が観察された。この効果はCys濃度25μMまで観察され、人体の血中遊離Cys濃度でもIPMの失活が起こり得ることが示唆された。またこの方法で評価したところ、Cysは他のカルバペネム薬（MEPM、BIPM、DRPM）に対しても同程度の失活効果を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、様々なヒト由来の培養細胞をある条件で培養すると細胞培養液中の抗菌薬（カルバペネム薬）が失活する現象のメカニズムの解明し、より有効な抗菌薬療法の確立を主な目的としてきた。上記のように、この現象における血清タンパク質の影響とそのメカニズムの解明、Cysのカルバペネム失活効果の評価法の確立という点では、一定の成果を得ることができた。また本研究と関連した研究の成果として、川崎市内の臨床分離菌のカルバペネム薬を含む抗菌薬に対する薬剤感受性のサーベイランスに関して、研究成果をまとめて論文にし、国際的な学術雑誌、学会等で報告することができた。このため達成度としては、(2) のカテゴリーとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年までの研究で、特定の条件で培養した細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活すること及び、この現象の大まかな挙動が明確になり、そのメカニズムとして培養細胞がLCを還元してCysを生成することが想定され、さらにCysのIPM失活活性は血清中のタンパク質とCysが結合することにより阻害されることが判った。さらにCysの抗菌薬失活活性を定量化する方法についても目処がたったので、今後は、Cysによるカルバペネム薬の失活活性の詳細を分析するとともに、細胞種や抗菌薬を変えて、その実態を検討し、in vitroの実験系に与える影響以外に、生体内での挙動、やアミノ酸製剤などの注射薬との相互作用などの解明をめざす。このためにMICの10倍濃度（10×MIC）のカルバペネム薬を含む培地中で、Cysを含む細胞培養液を段階的に希釈して添加した上で大腸菌を培養し、カルバペネム薬の活性が10%以下になる希釈倍率を比較検討できる実験系を構築することを考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、ヒト細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活する現象のメカニズムの解明のため、外注検査を含めて研究費用がかさむと考えられていたが、活性の挙動を解析する実験系が比較的安価で行えたため、研究費が予定よりも少なくて済んだ。また本研究と関連した研究として、川崎市内の臨床分離菌のカルバペネム薬を含む抗菌薬に対する薬剤感受性のサーベイランスシステムの構築を試みたが、学会発表、誌上発表の経費以外は、特に費用は掛からなかった。今年度も昨年同様に、研究成果を学術論文にまとめて発表することができたが、来年度も引き続き国際的な学術誌、学会等で成果の報告を行う予定で、そのために研究費を繰り越して使用したいと考えている。
ヒト培養細胞由来のCysがカルバペネム薬を失活することから、より多くの細胞、抗菌薬で同様の現象がみられないかを検討し、さらにカルバペネム薬の活性を10%以下まで失活するCys濃度を比較検討できる実験系を構築する計画があり、細胞や試薬、資材などを購入する。また、Cysによるカルバペネム薬失活効果を、HPLCなどを用いてより詳細に解析する計画がある。このため新たに細胞、抗菌薬、HPLCカラムなどの高額の試薬や器材を購入する予定である。またHPLC装置の整備に関する出費も予想される。さらに研究成果を、国際的な学会及び誌上で発表したいと考えており、その準備や遂行に費用が必要と思われる。
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