ノロウイルスの急激な感染拡大のメカニズムの解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09956
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 白土 東子 (堀越東子) 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (60356243)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 感染疫学 / ノロウイルス / 血液型抗原

研究実績の概要

ノロウイルスは小腸上皮に発現する血液型抗原を識別して感染する個体を決めている。ノロウイルス感染への感受性は個体の血液型によって異なる。しかし、ノロウイルスの流行拡大前後の疫学解析と、流行したウイルス株の血液型抗原への結合能の解析が両立されている報告はこれまでにない。本研究課題において、流行株の疫学解析と血液型抗原への結合能のin vitroにおける解析を両立させた研究を実施する。
本研究課題では、ネパールにおいて2009年を境に急激に流行を拡大させたGII.13遺伝子型株を解析の対象とし、以下の1)-3)の順に解析を進めることによって、ノロウイルスの血液型抗原結合能獲得が流行の規定要因であるという基本原理を証明する。1) ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のウイルス様中空粒子(VLP)の作製、感染拡大後のNPL2009株のVLP作製、世界的流行株 GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株のVLP作製を行う。2) ELISA、SPRを用いNPL2008株VLP(感染拡大前)、NPL2009株VLP(感染拡大後)、GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株VLP(世界的流行株)の血液型抗原結合能の評価を行う。3) NPL2009株(感染拡大後)の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ酸をNPL2008株(感染拡大前)のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する。
今年度は2)に取り組み、ELISAで使用する抗VLPウサギ血清の作製を行うとともに、血液型抗原結合能比較のためのELISAの条件検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究課題では、下記の1)-3)の順に解析を進めている。昨年度は1)に取り組み、ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のVLPの作出、感染拡大後のNPL2009株のVLP作出に成功し、電子顕微鏡下で粒子の形状を確認することが出来た。VLPは本研究課題の解析対象となる試料である。また、今年度は2)に取り組み、ELISAで使用する抗VLPウサギ血清の作製を行うとともに、血液型抗原結合能比較のためのELISAの条件検討を進めることが出来ている。このため、「おおむね順調に進展している」と判断した。
1) ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のウイルス様中空粒子(VLP)の作製、感染拡大後のNPL2009株のVLP作製、 世界的流行株GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株のVLP作製を行う。2) ELISA、SPRを用いNPL2008株VLP(感染拡大前)、NPL2009株VLP(感染拡大後)、GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株VLP(世界的流行株)の血液型抗原結合能の評価を行う。3) NPL2009 株(感染拡大後)の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ酸をNPL2008株(感染拡大前)のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する。

今後の研究の推進方策

ヒトに感染するヒトノロウイルスはヒトを唯一の感受性動物とし、感染モデル動物も培養細胞での増殖系も確立していない。ウイルス粒子の便への排出量は決して多くなく、in vitroでの解析に充分なウイルス粒子の調製は困難である。そこで、VLPの調製が有用であるが、VLP発現は容易ではなく、現在までに海外で発現の成功が報告されているのは約15株に留まっている。一方、代表者が所属する研究室では18遺伝子型25株のVLP発現に成功しており、代表者はこのうち13遺伝子型16株の血液型抗原19種類に対する結合パターンの解析を終えている。この13遺伝子型16株には2014年まで世界的に流行していたGII.4遺伝子型に属するNarita104株と日本国内の食中毒事例で分離されたGII.13遺伝子型Kashiwa47株を含む。
今後の研究を推進するため、既に解析を終えている13遺伝子型16株をコントロールに設定し、NPL2008株、NPL2009株のVLP-血液型抗原結合パターンの評価を行う。これにより、ウイルスカプシドタンパク質上の血液型抗原結合部位のアミノ酸変異が疫学的優勢に結びつくのか否かの検討を推進することが出来る。

次年度使用額が生じた理由

(理由) 研究段階の2)に当たる「ELISA、SPRを用いたNPL2008株VLP、NPL2009株VLPの血液型抗原結合能の評価」で用いるSPRに不具合が生じた。次年度使用額となっ た1,388,215円のうち670,000円分はSPR解析用のチップの購入に充てる予定であった分である。SPR解析用のチップは、1枚が33,500円と高額であり、解析対象とするNPL2008株、NPL2009株、Positive controlとして設定するGII.4遺伝子型株、Nagative cotrolとして設定するGII.1遺伝子型株、国内分離GII.13遺伝子型株の計5株のVLPの、6種の糖鎖に対する結合の評価に少なくも20枚必要である。残りの700,000円はSPRのシステムチェックに充てる予定である。
(使用計画) 平成30年度は、先ずSPRの立ち上げとNPL2008株VLP、NPL2009株VLPの糖鎖結合能の確認を行う。これらの基礎データを元に、研究段階3)に当たる「NPL2009株の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ 酸をNPL2008株のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する」をスタートさせる。

研究成果

• [学会発表] EFA-NIバイオセンサを用いた実環境サンプル中のノロウイルス様粒子検出 (2017)
  • 著者名/発表者名: 安浦雅人、白土東子、守口匡子、藤巻真
  • 学会等名: ケミカルセンサ研究会