ヘッジホッグシグナル異常症に対するゲノム編集と先制医療

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09960
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 藤井 克則 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (70344992)
• 研究分担者: 宮下 俊之 北里大学, 医学部, 教授 (60174182) ; 梅澤 明弘 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 再生医療センター, 副所長/再生医療センター長 (70213486)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ヘッジホッグ / Gorlin症候群 / 基底細胞母斑症候群

研究実績の概要

ヘッジホッグシグナルは高度に保存された細胞の増殖シグナルであり、その異常はヒトの先天奇形と発癌（基底細胞癌と髄芽腫）に深く関与する。本経路はリガンドであるヘッジホッグ、受容体のPTCH1、隣接タンパクのSMO、転写因子のGLIから構成され、Gorlin症候群はこのPTCH1のヘテロ欠損により発症する。今回Gorlin症候群患者4名の皮膚線維芽細胞より作製したiPS細胞(GS-iPSC)と正常対照iPS細胞（WT-iPSC）用い、SFEBq法により神経前駆細胞を誘導（GS-NPCおよびWT-NPC）作製した。
GS-iPSCとWT-iPSCは非刺激状態においてヘッジホッグ標的遺伝子（GLI1、HHIP、PTCH1）の発現レベルに差は認めなかったが、WT-NPCは、WT-iPSCと比較して非常に低いGLI1発現遺伝子レベルを示す一方、GS-NPCではiPSCと同様のGLI1発現レベルを示した。GS-iPSC、WT-iPSCはSMO阻害剤加えても標的遺伝子の発現には変化を認めず、GS-NPCではSMO阻害剤により著明にGLI1発現が抑制された一方、WT-NPCではSMO刺激剤を加えてGLI１の発現が著明に上昇した。これらよりGorlin症候群患者由来iPS細胞から分化誘導した神経前駆細胞はヘッジホッグ関連腫瘍発生のモデルであり、薬剤スクリーニング系として有用であることが示唆された。
また遺伝子編集により残る正常アレルを破壊した細胞を作製しそれらの細胞生物学的特性を解析した。Gorlin患者由来iPS細胞（PTCH1+/-iPSCs）にCRISPR/Cas9発現ベクターを導入してクローンを単離後、患者由来の変異アレルに加えて、残存する正常アレルにも変異を生じたiPS細胞を（PTCH1-/- iPSCs）を免疫不全マウスに皮下移植して得られたテラトーマで外胚葉への分化誘導を確認した。

研究成果

• [雑誌論文] Gorlin症候群の遺伝子診断 (2019)
  • 著者名/発表者名: 宮下俊之、高山吉永
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 268 ページ: 123-126
• [雑誌論文] MicroRNAs profiling in fibroblasts derived from patients with Gorlinsyndrome (2019)
  • 著者名/発表者名: Shiohama T., Fujii K., Miyashita T., Takatani T., Ikehara H., Uchikawa H., Motojima T., Uchida T, Shimojo N
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel PTCH1 mutation in basal cell nevus syndrome with rare craniofacial features (2019)
  • 著者名/発表者名: Murata Y, Kurosaka H, Ohata Y, Aikawa T, Takahata S, Fujii K, Miyashita T, Morita C, Inubushi T, Kubota T, Sakai N, Ozono K, Kogo M, Yamashiro T.
  • 雑誌名: Human Genome Variation 巻: 6 ページ: 16
  • DOI: doi: 10.1038/s41439-019-0047-9. eCollection 2019
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 次世代シークエンサーを用いたGorlin症候群患者に発症した各種腫瘍の遺伝子解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 兼友裕大、高山吉永、初瀬洋美、藤谷和子、長尾 和右、亀山 孝三、宮下 俊之
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [備考] 千葉大学大学院医学研究院小児病態学神経グループ
  • URL: http://www.m.chiba-u.jp/dept/pediatrics/research/group/nerve/