| 研究課題/領域番号 |
16K09961
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
守田 雅志 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (20191033)
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| 研究分担者 |
長井 良憲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 客員教授 (30431761)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 副腎白質ジストロフィー / ペルオキシソーム / 神経変性疾患 / 極長鎖脂肪酸 / 骨髄移植 / ABCD1 / ミクログリア |
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| 研究実績の概要 |
副腎白質ジストロフィー(ALD)はペルオキシソーム膜ABCタンパク質ABCD1の機能欠損を原因とする難治性の神経変性疾患で、発病初期の骨髄移植が神経変性に対して抑制効果を示すことが知られている。しかし、その機序は解明されていない。本研究では、骨髄移植による抑制機構を解明する目的で、abcd1欠損マウスに野生型もしくはabcd1欠損のGFP発現骨髄細胞を移植し、移植マウス各組織の組織化学染色、及び遺伝子発現解析を行った。
移植したマウスでは、末梢血のドナー由来細胞の割合が移植6ヶ月後においても90%以上を維持しており、移植がうまくできていることを確認した。脳や脊髄ではドナー由来GFP陽性細胞の分布が認められ、そのほとんどはIba1陽性を示しており、骨髄細胞が脳内に侵入後、マクロファージ様細胞に分化し生着していることが確認された。野生型骨髄細胞（wild-GFP）とabcd1欠損骨髄細胞（KO-GFP）を移植したレシシピエントマウス間でGFP陽性細胞の分布や数、形態に違いは認められなかった。abcd1欠損マウス脳では極長鎖脂肪酸含量の増加が認められるが、骨髄移植による低下は認められなかった。この結果より、骨髄移植による神経変性の抑制は極長鎖脂肪酸含量の低下によるものではないことを明らかにした。一方、遺伝子発現解析ではCh25h遺伝子の発現が野生型マウスに比べてabcd1欠損マウスで増加しており、野生型骨髄細胞を移植したマウスで有意に減少していた。Ch25h遺伝子の発現は炎症反応に関わっていることから、骨髄移植では脳内に生着したマクロファージ様細胞が炎症反応を抑制していることが考えられた。この結果は、発症機構、及び骨髄移植による発症抑制機構を解明する上で重要な知見である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね順調に進展している。計画では移植したマウス大脳のドナー由来ミクログリア様細胞を単離してその性状を解析する予定であったが、セルソーティングにより調製した細胞数が極めて少なかったことから、DNAマイクロアレイ等による解析はできなかった。骨髄移植による神経変性に関わる生化学的指標については、当初考えていたミトコンドリアの機能障害、オートファジー機能低下、リソソームへの遊離コレステロールの蓄積に着目していたが、有意な違いは認められなかった。現在、移植マウス大脳のDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行い、骨髄移植により変動する遺伝子を同定することにより、生化学的指標の探索を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
骨髄移植により、中枢神経系におけるCh25h遺伝子の発現抑制が確認された。この酵素の産物である25-ハイドロキシコレステロールの中枢神経系における含量の測定を行い、神経変性と関連性があるかどうか検証する予定である。また、DNAマクロアレイにより、骨髄移植により変動する遺伝子を同定し、その遺伝子産物について解析を行う。一方、ドナー由来マクロファージ系細胞の神経変性抑制因子を同定するため、in vitro実験系の構築を計画している。abcd1欠損アストロサイトと、野生型もしくはabcd1欠損マウス由来骨髄マクロファージもしくはミクログリアの共培養系を構築し、骨髄移植によるin vivoの現象が再現できるかを検討する。in vitroの実験系が構築できれば、マクロファージ系細胞が産生する因子の同定を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
移植マウスの脳に生着したドナー由来マクロファージ系の細胞の性状を明らかにする計画で、移植マウス脳からミクログリア画分を調製し、FACSによる分離を行いGFP陽性のドナー由来の細胞の単離を行った。当初の計画ではこの単離した細胞のDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を考えていたが、予想より細胞数が少なく遺伝子発現解析ができなかった。そのため次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は、神経変性抑制機構を解明するためアストロサイトとミクログリアの初代培養系の調製を行い、abcd1欠損による生化学的障害を解析する。特に前年度の結果より、25-ハイドロキシコレステロールの代謝に着目して解析を行う予定である。このため、特異的な抗体や質量分析の試薬を購入する予定である。
さらに、アストロサイトとミクログリアの共培養による実験系を構築し、ミクログリアが産生する神経変性抑制に関わる分子の同定を行う予定である。このため、トランスウェルなどの培養器具やサイトカイン検出用試薬等を購入する予定である。
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