| 研究課題/領域番号 |
16K09964
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
橋詰 令太郎 三重大学, 医学系研究科, 助教 (50456662)
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| 研究分担者 |
宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
緒方 藍歌 名古屋大学, 医学系研究科, 研究員 (70718311)
高成 広起 徳島大学, 病院, 特任講師 (70723253)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ダウン症候群 / トリソミー / 染色体工学 / ゲノム編集 / iPS細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ダウン症候群由来細胞を用いて、トリソミックレスキュー、すなわち過剰な21番染色体を消去する方法の科学的探索および確立、ならびに知見を統合して最適な新規治療用遺伝子ベクターの構築を志向するものである。本研究では、新規に承認された臨床研究として、両親の部分的なゲノム情報とともに、新たにトリソミー21由来細胞を調達し、研究の基盤を構築した。取得した細胞はiPS細胞化し、クローニングや将来的に分化誘導研究を容易かつ可能とした。また、核型判定のため、各種遺伝学的評価法（FISH、染色体伸展像、digital PCR、MLPA法、G-banding等）を確立した。また、研究を行うための実験計画の機関内承認（臨床研究1、組換えDNA実験計画7、動物実験計画1）の取得、特定の遺伝子を発現するウイルスおよび非ウイルス性の複数の発現ベクターの構築がなされた。
一方、in vivo使用のベクターとして本研究ではエクソソーム（細胞外小胞）に重点を置いている。エクソソームを細胞培養上清から超遠心法ないしホスファチジルセリンに結合するタンパク質と磁気ビーズを利用したアフィニティー法にて分離し、透過型電子顕微鏡にて確認した。本エクソソームを用いて、蛍光蛋白質をコードするプラスミドベクターの導入効率は比較的良好であった。トリソミー21のiPS細胞を用いた実験では、ダイソミー21のiPS細胞と比し検出可能な増殖速度の差異を指摘できないこと、ダイソミー21のiPS細胞と比して培養中の自然発生的な細胞分化の割合に差異を認めないこと、20継代以上の比較的長期培養においても核型が変化しないことが分明となった。また、人iPS細胞への一過性遺伝子発現の誘導法としては、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（PIV2）ベクターが、細胞毒性が少なく有用である事が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度は、複数の実験計画の施設内承認、核型正常化作用があるとされる遺伝子のクローニング、複数の染色体解析の評価法の確立、トリソミー21由来線維芽細胞のiPS細胞化と発現遺伝子の解析を主として行った。
第2年度では、トリソミー21-iPS細胞のhaplotype phasingを行った。具体的には、inverted loxP間に、ポジティブセレクションマーカーとネガティブセレクションマーカー（puroΔTK）を配置したトランスジーンを、特定の21番染色体にCRISPR/Cas9システムを用いて挿入し、Cre蛋白質を発現させて染色体の消去を行った。トリソミー21の各21番染色体を消去したダイソミーiPS細胞株を3株樹立し、SNPを中心とした塩基配列を解析し、phasingを行った。すなわち、父親由来の21番染色体をF、母親由来のそれをM1, M2とした場合（オリジナル細胞は、F-M1-M2）、M1-M2, F-M1, F-M2の21番染色体のみを保有するダイソミー細胞株を各々樹立し、シーケンスを行った。細胞培養上の挙動としては、少なくとも増殖曲線においては、トリソミーとダイソミー細胞間で、優位な差異を認めなかった。
また、核型正常化作用があるとされる遺伝子を、各種遺伝子発現データベース上の情報を用いて絞り込みを行い、一部はcDNAから、一部は人工遺伝子合成によりクローニングした。当初、一過性発現を意図し、mRNAの細胞内導入を行った。しかしながらiPS細胞に対する一般的なリポフェクションを用いた核酸導入法では、mRNA専用試薬を用い、毒性を軽減するためmRNAの塩基修飾を試みたものの、導入効率が極端に悪いことが判明した。このため、細胞質型ウイルスベクターである、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（PIV2）ベクターを用いることにより課題を解決した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も引き続き、トリソミー21由来細胞を用いて、核型正常化作用があるとされる遺伝子のin vitroでの細胞内導入、その後の核型の詳細な評価を行う。シングルセルクローニングが比較的短時間で行えるiPS細胞を中心に実験を進め、最終的には生体内での分化細胞である線維芽細胞を用いて評価を行う。また、エクソソームの生体内ベクターとしての有用性評価を継続する。これは、将来的に、本プロジェクトでの核型正常化作用があるとされる遺伝子の導入以外の戦略においても、現実的で有用であると考えられるからである。現在行っている、核型正常化作用を有すると推定される遺伝子を用いた実験で、良好な結果を得ない場合は、再度、絞り込みとクローニング、細胞内導入を粘り強く行う必要がある。次いで、in vitroの細胞培養系において、候補遺伝子を封入したエクソソームを用い、ベクターとしての実際の有用性を評価する。さらに、これらエクソソームベクター投与が、正常核型を有する小動物にいかなる有害事象を生ぜしめるのかを把握する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【金額未定のため】
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