低頻度モザイク変異検出技術を用いた生殖細胞モザイク変異の推定診断法開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K09975
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 加藤 光広 昭和大学, 医学部, 教授 (10292434)
• 研究分担者: 中村 和幸 山形大学, 医学部, 助教 (20436215)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: モザイク変異 / de novo変異 / デジタルPCR / 次世代シーケンサー

研究実績の概要

両親の保因者検査が陰性のde novo変異では、次子への再発率は低いが、両親のどちらかの生殖細胞モザイク変異によって、罹患児の両親における同胞の再発率は一般集団より高くなる。生殖細胞モザイク変異の頻度は疾患毎に異なるが、生殖細胞モザイク変異の正確な頻度の測定は難しく、多くの疾患では生殖細胞モザイク変異の頻度は不明である。近年解析技術の進歩によりモザイク変異の検出機会が増えており、モザイク変異の頻度は従来考えられていたよりも多いと考えられる。低頻度体細胞モザイク変異の診断法を開発し、より正確な遺伝相談に寄与する。これまでに脳形成障害とてんかん症候群を中心に小児神経疾患の原因遺伝子解析を行い、患児と両親のトリオ検体で年間200家系以上を新たに収集した。その結果、初年度は47例、昨年度53例、今年度は85例のde novo変異を同定した。モザイク変異の検出法として、次世代シーケンサーを用いたディープシーケンスのためのカスタムターゲットパネルを作成し、脳形成異常、早期発症てんかん性脳症など 19例でde novo変異を同定したが、患児および両親の検体にモザイク変異を疑わせる変異アレルと野生型アレルの比率の偏りはなかった。当初はde novoと考えられたDCX変異で変異アレルを疑わせるピークが認められた母親の検体を用いて、Taqmanプローブを用いてデジタルＰＣＲ法による検証を行ったが、変異アレルは検出できなかった。本変異については、さらに手技的な見直しを行い再検証予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

遺伝子解析の症例集積は患児と両親のトリオ検体で年間200家系以上が新たに収集されており、de novo変異の同定は順調に進んでいる。しかし、親の体細胞モザイク変異が疑われる例は少なく、まだ低頻度生殖細胞モザイク変異を同定できていない。デジタルＰＣＲによるモザイク変異の検出を陽性コントロールを用いて確認を行ったが、上手く検出できなかった。

今後の研究の推進方策

親の生殖細胞モザイク変異の可能性があるきょうだい発症例を積極的に収集解析する。カスタムターゲットパネルを用いてディープシーケンスを行い、微量な変異アレルの検出を行うと共に、変異検出の最少限界を調べる。デジタルＰＣＲによるモザイク変異検出技術を確立し、Sanger法では変異アレルが検出されない両親検体を解析する。dCAPS法とサイクリングプローブ法による定量PCRを行う。

次年度使用額が生じた理由

7月に交通事故に遭い入院加療を余儀なくされ、一時的に実験ができなかった。また、デジタルPCRによる低頻度モザイク変異検出が当初の想定より難しく、追加の実験が必要になっているため、山形大学医学部小児科の中村和幸助教を研究分担者に加えて解析を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] De novo variants in CAMK2A and CAMK2B cause neurodevelopmental disorders (2018)
  • 著者名/発表者名: Akita Tenpei、Aoto Kazushi、Kato Mitsuhiro、Shiina Masaaki、Mutoh Hiroki、Nakashima Mitsuko、Kuki Ichiro、Okazaki Shin、Magara Shinichi、Shiihara Takashi、Yokochi Kenji、Aiba Kaori、Tohyama Jun、Ohba Chihiro、Miyatake Satoko、Miyake Noriko、Ogata Kazuhiro、Fukuda Atsuo、Matsumoto Naomichi、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Annals of Clinical and Translational Neurology 巻: 5 ページ: 280～296
  • DOI: 10.1002/acn3.528
  • 査読あり
• [雑誌論文] A recurrent homozygous NHLRC1 variant in siblings with Lafora disease (2018)
  • 著者名/発表者名: Araya Nami、Takahashi Yukitoshi、Shimono Masayuki、Fukuda Tomofumi、Kato Mitsuhiro、Nakashima Mitsuko、Matsumoto Naomichi、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Human Genome Variation 巻: 5 ページ: 6~9
  • DOI: 10.1038/s41439-018-0015-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] De novo mutations of the ATP6V1A gene cause developmental encephalopathy with epilepsy (2018)
  • 著者名/発表者名: Fassio Anna、Esposito Alessandro、Kato Mitsuhiro、Saitsu Hirotomo、et al.
  • 雑誌名: Brain 巻: 141 ページ: 1703～1718
  • DOI: 10.1093/brain/awy092
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The ARID1B spectrum in 143 patients: from nonsyndromic intellectual disability to Coffin?Siris syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: van der Sluijs PJ, Jansen S, Vergano SA, Adachi-Fukuda M, Alanay Y, AlKindy A, Baban A, Bayat A, Beck-Wodl S, Berry K, Bijlsma EK, Bok LA, Brouwer AFJ, van der Burgt I, Campeau PM, et al.
  • 雑誌名: Genetics in Medicine 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1038/s41436-018-0330-z
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Novel biallelic SZT2 mutations in 3 cases of early-onset epileptic encephalopathy (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuchida N.、Nakashima M.、Miyauchi A.、Yoshitomi S.、Kimizu T.、Ganesan V.、Teik K.W.、Ch'ng G.-S.、Kato M.、Mizuguchi T.、Takata A.、Miyatake S.、Miyake N.、Osaka H.、Yamagata T.、Nakajima H.、Saitsu H.、Matsumoto N.
  • 雑誌名: Clinical Genetics 巻: 93 ページ: 266～274
  • DOI: 10.1111/cge.13061
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of copy number variations in epilepsy using exome data (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuchida N.、Nakashima M.、Kato M.、et al.
  • 雑誌名: Clinical Genetics 巻: 93 ページ: 577～587
  • DOI: 10.1111/cge.13144
  • 査読あり
• [雑誌論文] De novo variants in SETD1B are associated with intellectual disability, epilepsy and autism (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiraide Takuya、Nakashima Mitsuko、Yamoto Kaori、Fukuda Tokiko、Kato Mitsuhiro、Ikeda Hiroko、Sugie Yoko、Aoto Kazushi、Kaname Tadashi、Nakabayashi Kazuhiko、Ogata Tsutomu、Matsumoto Naomichi、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Human Genetics 巻: 137 ページ: 95～104
  • DOI: 10.1007/s00439-017-1863-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic literacy series: Primer part 2-Paradigm shifts in epilepsy genetics (2018)
  • 著者名/発表者名: Helbig Ingo、Heinzen Erin L.、Mefford Heather C.、the International League Against Epilepsy Genetics Commission
  • 雑誌名: Epilepsia 巻: 59 ページ: 1138～1147
  • DOI: 10.1111/epi.14193
  • 国際共著
• [雑誌論文] De novo PHACTR1 mutations in West syndrome and their pathophysiological effects (2018)
  • 著者名/発表者名: Hamada Nanako、Ogaya Shunsuke、Nakashima Mitsuko、Nishijo Takuma、Sugawara Yuji、Iwamoto Ikuko、Ito Hidenori、Maki Yuki、Shirai Kentaro、Baba Shimpei、Maruyama Koichi、Saitsu Hirotomo、Kato Mitsuhiro、Matsumoto Naomichi、Momiyama Toshihiko、Nagata Koh-ichi
  • 雑誌名: Brain 巻: 141 ページ: 3098～3114
  • DOI: 10.1093/brain/awy246
  • 査読あり
• [学会発表] HECW2 mutation causes periodic attacks of paralysis, intellectual disability and hypotonia (2018)
  • 著者名/発表者名: Kazuyuki Nakamura, Takahiro Abiko, Takashi Kanbayashi, Mitsuko Nakashima, Hirotomo Saitsu, Naomichi Matsumoto, Mitsuhiro Kato
  • 学会等名: 15th International Child Neurology Congress
  • 国際学会
• [学会発表] De novo variants affecting autoinhibition of Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, cause neurodevelopmental disorders (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirotomo Saitsu, Tenpei Akita, Kazushi Aoto, Mitsuhiro Kato, Masaaki Shiina, Hiroki Mutoh, Mitsuko Nakashima, Ichiro Kuki, Shin Okazaki, Shinichi Magara, Takashi Shiihara, Kenji Yokochi, Kaori Aiba, Jun Tohyama, Chihiro Ohba, Satoko Miyatake, Noriko Miyake, Kazuhiro Ogata, Atsuo Fukuda, Naomichi Matsumoto
  • 学会等名: American Society of Human Genetics
  • 国際学会
• [学会発表] Epileptic spasms in five children carrying WDR45 mutations (2018)
  • 著者名/発表者名: Taikan Oboshi, Yukitoshi Takahashi, Asako Horino, Yuiti Kimizu, Shinsaku Yoshitomi, Tokito Ymaguchi, Hiroko Ikeda, Hidenobu Otani, Katumi Imai, Hideo Shigematsu, Yushi Inoue, Mitsuhiro Kato
  • 学会等名: 19th International Symposium on Severe Infantile Epilepsy Treatment
  • 国際学会
• [学会発表] Biallelic variants in CNPY3 cause West syndrome with hippocampal malrotation and characteristic fast waves (2018)
  • 著者名/発表者名: Mitsuhiro Kato, Hiroki Mutoh, Tenpei Akita, Takuma Shibata, Hiroyuki Wakamoto, Hiroko Ikeda, Hiroki Kitaura, Kazushi Aoto, Mitsuko Nakashima, Tianying Wang, Chihiro Ohba, Satoko Miyatake, Noriko Miyake, Akiyoshi Kakita, Kensuke Miyake, Atsuo Fukuda, Naomichi Matsumoto, Hirotomo Saitsu
  • 学会等名: 13th European Congress on Epileptology
  • 国際学会