| 研究課題/領域番号 |
16K09978
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| 研究機関 | 千葉県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
越川 信子 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 主席研究員 (90260249)
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| 研究分担者 |
渡部 隆義 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 研究員 (60526060)
永瀬 浩喜 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 研究所長 (90322073)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | PIポリアミド / ミトコンドリアDNA / A3243G変異 |
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| 研究実績の概要 |
PIPolyamide (PIP)は、単体でミトコンドリアに到達できるが、48時間後には排出されることが判った。そこで、電位差から物質をミトコンドリアへ送達するとされるpolyphenylphosphonium (TPP)カチオンと結合し(PIP-TPP)、長期滞留するか否かを検討した。この時、英国ケンブリッジのDr. Murphyから抗TPP抗体の供与を受け、cytochrome Cとの共染色を行なった。その結果、投与4日目、14日目においてミトコンドリア内にPIP-TPPの存在を確認できた。また、この際,
抗TPPと抗チトクロムC抗体の二重染色によりPIP-TPPがミトコンドリア内膜内に達していることが明らかとなった。そこでPIP-TPPをHeLa細胞を母体としたmt3243 A>G変異を55%含有するcybridに60日間に渡り長期間投与し、mtDNAの総コピー数を推定するため、COII遺伝子とβactinの比率をPCRで推測した。その結果、処理期間が長いほど、また、PIP-TPPの濃度が高いほどmtDNAのコピー数が多い傾向にあることが観察された。さらに変異mtDNAと正常mtDNAのコピー数の変化をPCRと制限酵素を組み合わせた解析を用いて検討した。その結果、mt3243の野生型のmtDNAコピー数が変異型のmtDNAコピー数に比べ多くなっている傾向が伺われた。今回までの研究で問題となるのは、１）高濃度のPIP-TPPを必要とすること ２）長期間の処理が必要であること であった。そこで、これらの２点を解決するため、PIPの構造・合成過程にさらに検討を加えること。また、HeLaを母体とするcybridだけでなく、患者由来fibroblastでの検討を試みていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ミトコンドリアDNA変異に対するPIポリアミドを複数合成することにより、最適な合成方法を模索するため期間を要した。また、PIポリアミドだけではミトコンドリアへの送達・滞留に不十分であることからtriphenylphosphonium(TPP)を使用することとした。TPPを用い、ミトコンドリアへPIポリアミドが送達されているかを抗TPP抗体で検出するため、英国ケンブリッジのDr.Murphyから抗TPP抗体の供与を受けるまでに期間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
PIポリアミドの合成を人員を増やして急ぐ。 またポリアミドの構造を再検討し、複数の構造で合成を試みさらに、精製方法を再検討する。また、現在はcybridを用いて実験を行なっているが、患者由来のfibroblastを用いた検討も行うべく準備をしている。さらに、北大 山田勇磨准教授との共同研究で、MITO porterを利用したミトコンドリアへのPIPの導入も視野に入れて研究を展開していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
PIポリアミド合成のための試薬に多額の費用がかかることから、次年度使用額が生じた。また、細胞培養、生化学的解析、細胞染色等の試薬の購入にも資金が必要となった。
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