2017 年度実施状況報告書

ヒト誘導多能性幹細胞を用いた遺伝性筋疾患の創薬研究のための基盤技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号	16K09988
研究機関	京都大学
研究代表者	粟屋智就京都大学, 医学研究科, 特定助教 (20589593)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	iPS細胞 / 骨格筋 / 遺伝性筋疾患 / 創薬
研究実績の概要	本研究は「細胞-細胞外基質の相互作用や培地・細胞解離試薬などの細胞外環境がその後の分化誘導の効率を変化させる」という仮説に対して、MyoD-iPS細胞を用いた分化誘導実験とその分化課程における網羅的遺伝子発現解析によりアプローチし、最終的には均質な骨格筋細胞を 96-well ないしは 384-well 細胞培養プレートで効率的に培養し、ハイスループットな薬剤スクリーニング系 (HTS) 発展させる基盤を形成することが目的である。研究計画では平成29年度中に種々の未分化培養条件の検体を収集し、網羅的遺伝子発現解析を予定していたが、平成28年度報告の通り、馴化培養における培養条件の変更等により検体収集に遅れが生じていたため、引き続き検体収集を中心とした実験を行った。標準的iPS細胞である 253G4 および 409B2 細胞株を用いて、SNL フィーダー細胞上で 20%KSR を含有する培地で維持培養を行う原法、mTeSR1, StemFit AK02N, E8 の各種培地を用いて、Matrige, VTN-N, Geltrex, iMatrix-511 上で培養を行い検体を収集した。Geltrex は他社製培地との組み合わせで有効な培養系が確立できなかった。また、iMatrix-511 上で継代数を重ねた細胞は Matrigle および VTN-N への接着性が低下した。また並行して一部の条件で骨格筋分化誘導の予備的検討を開始した。最終年度には平成29年度までに収集した検体を用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、特にこれらの接着性の差異を生じる遺伝子変動を見出すことを目的としている。また骨格筋分化培養に変動を与える因子について検討する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由昨年度報告の通り、様々な培養条件における細胞の発現解析を手法としているが、iPS細胞が培養条件 (培地と細胞外基質の組み合わせ) においては接着しなかったり増殖しなかったりし、市販の培地や細胞外基質の組み合わせにおいても宣伝されているほどの安定性がみられないものが複数条件みられたため、検体の収集が遅れた。一方で、骨格筋分化誘導の予備的検討では分化誘導開始後に継代操作を行うことで、ある条件においてウェル毎のばらつきの少ない比較的均質な培養系を構築することに成功した。様々な培養特性の把握が出来たことで、最終目標であるハイスループットな薬剤スクリーニング系 (HTS) に有益な予備情報が得られ、有意義な成果も上げられたため、全体としては概ね順調な進展と考えている。
今後の研究の推進方策	収集した検体を用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、遺伝子変動と接着性との関連についての検討を行うとともに、各種条件から骨格筋細胞への分化誘導を行い、実際の分化効率と遺伝子発現変動との関連について検討する。また、骨格筋分化誘導の予備的検討では分化誘導開始後に継代操作を行うことで、ある条件においてウェル毎のばらつきの少ない比較的均質な培養系を構築することに成功した。これらの特性を遺伝子発現レベルで比較検討する。
次年度使用額が生じた理由	網羅的遺伝子発現解析のタイムスケジュールがずれ込んだため、その解析に用いる消耗品の費用を来年度に持ち越した。また、学内資金により一部の解析を行うことがかのうであったため、今年度の物品費の使用を当初より少なく抑えることが可能であった。次年度は最終年度であるが、今年度までに行った検体を大量に解析する必要があるため、持ち越した物品費は網羅的遺伝子発現解析を中心とした解析を実施するのに必須である。引き続き物品費として消耗品の購入に充当する。