| 研究課題/領域番号 |
16K09994
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
綾田 稔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90222702)
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| 研究分担者 |
小島 裕正 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (40336772)
瀬戸 俊之 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (60423878)
桑村 充 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20244668)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ウイルス / 麻疹ウイルス / 亜急性硬化性全脳炎 |
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| 研究実績の概要 |
組換え麻疹ウイルスを用いて、亜急性硬化性全脳炎（SSPE）の脳内感染拡大のメカニズムを明らかにし、SSPE株に生じた特徴を利用した組換えウイルスを重感染させることによってSSPEを治療する動物モデルを樹立することが目的である。
今年度は、引き続きN、P、M、L遺伝子からなるプラスミドと、F、H遺伝子、およびマーカーとして緑色蛍光蛋白をコードするhrGFP遺伝子からなるプラスミドより、2分節からなるウイルスの作製を行った。F遺伝子がSSPE大阪1株に相当するウイルス(IC/NPML+F[OSA1]HhrGFP)に加えて、新たにF遺伝子がSSPE大阪2株に相当するウイルス(IC/NPML+F[OSA2]HhrGFP)、およびIC323株のF遺伝子のアミノ酸の一部を置換したウイルス(IC/NPML+F[T461I]HhrGFP)を作製することに成功した。新たに作製された2種類のウイルスは、IC/NPML+F[OSA1]HhrGFP と同様、Vero細胞に感染して細胞融合を引き起こすことが確認された。このことから、分節型のウイルスは、細胞指向性については非分節型のウイルスと同じ性質を有することが確認された。
また、IC/NPML+F[OSA2]HhrGFP およびIC/NPML+F[T461I]HhrGFPをハムスターの脳内に接種して、病原性の有無を検討した。その結果、IC/NPML+F[OSA2]HhrGFP感染3～4日後にハムスターは過敏、けいれん等の神経徴候を呈して発症したが、麻痺などの後遺症を残しながらも生残する傾向が見られた。また、IC/NPML+F[T461I]HhrGFPは、今回接種したウイルス量では発症が見られなかった。これらのことから、分節型のウイルスの場合には非分節型のウイルスよりも病原性が低下していることが示唆され、研究目的達成に向けて有用な情報と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新たに2つのゲノムからなる分節型組換え麻疹ウイルス2種類の作製に成功した。今回作製された組換えウイルスはin vitroにおいては予想通りで、in vivoにおいては病原性の低下を示唆する結果を得たことから、仮に非分節型のウイルス感染細胞に分節型のウイルスが重感染した場合、当初の予想通りウイルスの複製が阻害される可能性が示唆される。また、H蛋白の変異と神経病原性との関連に関する検討を続けており、予備的検討の段階ではあるが、少し進展が見られている。しかしながら、目標としている欠損型ゲノムを作製するために不可欠なウイルス蛋白発現細胞の作製が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、作製されたSSPE株のF遺伝子を有する2分節型のウイルス（IC/NPML+F[OSA1]HhrGFPおよびIC/NPML+F[OSA2H]hrGFP）の性状について、培養細胞における増殖曲線、通常のウイルスとの重感染の可能性、干渉作用の有無について検討する。重感染したウイルスを判別するために赤色蛍光蛋白を発現する遺伝子を組み込んだウイルスを既に作製したのでこれを利用する予定である。また、N、P、L遺伝子とM、F、H遺伝子との組み合わせからなるウイルスの作製を行って、in vitro、in vivoの実験により、これまでに作製したウイルスと比較検討する。
次に、P遺伝子の変異とインターフェロン応答への影響を検討する。既にSSPE大阪1株および大阪2株のP遺伝子の変異を解析し、通常の麻疹ウイルス、ワクチン株由来でインターフェロン応答の欠損が報告されているEdmonston-tag株、SSPE由来の大阪1株および大阪2株よりP遺伝子のプラスミドへのクローン化を行った。P遺伝子にはP、V、Cの3種類の蛋白がコードされていることから、このプラスミドよりP蛋白のみの発現、V蛋白のみの発現、C蛋白のみの発現プラスミドを作製し、それぞれのウイルス由来の蛋白についてインターフェロン応答の解析を行って比較検討する。そして、P遺伝子の変異をもつ組換えウイルスを作製して、培養細胞における感染実験、およびハムスターへの感染実験系で検討する。
遺伝子欠損型の組換え麻疹ウイルスを作製するためのN、P、L蛋白発現細胞の作製を行う。レンチウイルスベクターを利用するため、既にベクターへの麻疹ウイルス遺伝子の挿入を開始しており、今後、細胞へ導入し発現を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね当初の計画どおりに進行しているが、備蓄の試薬・消耗品の利用が可能で、組換えウイルスの作製および動物実験に要した経費が少額であった。残額は次年度に繰り越して使用することが適切と判断した。
研究費は、組換えウイルスの作製および動物実験に使用する他、塩基配列の決定等のための消耗品に使用する。特に新たな高額備品は必要ではないが、実験に不可欠な備品の修理の必要が生じた場合には修理費に当てる。また、これまでに達成された結果をまとめて論文にするため、論文の校正・投稿・掲載のための費用を予定している。
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