| 研究課題/領域番号 |
16K09994
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
綾田 稔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90222702)
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| 研究分担者 |
小島 裕正 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (40336772)
瀬戸 俊之 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (60423878)
桑村 充 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20244668)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ウイルス / 麻疹ウイルス / 亜急性硬化性全脳炎 |
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| 研究実績の概要 |
組換え麻疹ウイルスを用いて、亜急性硬化性全脳炎（SSPE）の脳内感染拡大のメカニズムを明らかにし、SSPE由来の株に生じた特徴を利用した組換えウイルスを重感染させることによってSSPEを治療する動物モデルを樹立することが目的である。
P遺伝子の変異とインターフェロン応答への影響を検討するため、麻疹ウイルス野生株、ワクチン株由来でインターフェロン応答の欠損が報告されているEdmonston-tag株、SSPE大阪1株、および大阪2株のP遺伝子をもつウイルスを作製した。また、P遺伝子にはP、V、Cの3種類の蛋白がコードされているが、V蛋白の発現を欠損したウイルス、C蛋白の発現を欠損したウイルスも作製した。
SSPE大阪1株またはSSPE大阪2株のF遺伝子をもつウイルスを脳内接種されたハムスターは、脳内接種3－4日後に過敏・けいれん等の症状を呈して発症し数日以内に死亡するのに対して、SSPE株由来のF遺伝子をもちながらP遺伝子をEdmonston-tag株に置換したウイルスを脳内接種した場合には、数時間の発症遅延の後に過敏・けいれん等の症状を呈して発症するものの、その翌日以降、急速に回復傾向を示し、生残することが明らかになっている。今回、野生株のIC323株のP遺伝子のV蛋白の発現を欠損させた遺伝子をもつウイルスでは、Edmonston-tag株のP遺伝子をもつウイルスと同様、発症後に回復することが明らかになった。一方、SSPE大阪1株またはSSPE大阪2株のF遺伝子とSSPE株由来のP遺伝子をもつウイルスは、脳内接種3－4日後に過敏・けいれん等の症状を呈して発症し、数日以内に死亡したことから、SSPE株のP遺伝子には多くの変異が生じているものの、その機能は保持されていることが示唆された。今後SSPE株のV蛋白、C蛋白の個別の機能について検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ウイルスの複製とインターフェロンの誘導・応答抑制に不可欠なP遺伝子の変異は神経病原性にも影響を与えることが明確になり、神経病原性を低下させる要素として、また治療への応用という観点からも、さらなる検討が必要であることが示された。また、P遺伝子の変異を検討する実験において、SSPE由来のF遺伝子を持つウイルスを用いる実験系が有用であることも再確認され、この実験系を用いてSSPE株のP遺伝子に変異が生じているものの機能していることが明らかになった。P遺伝子の中で、V蛋白の発現が病原性に関与していることが示唆されたが、C蛋白に関しても解析する必要がある。現在、それぞれの蛋白の役割についてin vitroの実験系で確認する予定である。
欠損型ウイルスを作製するための蛋白発現細胞の作製が遅れているが、そのためのレンチウイルスベクターへ挿入したプラスミドの作製は終了している。また、非分節型ウイルスによる分節型ウイルスの干渉現象の確認が未確認である。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製されたSSPE株のF遺伝子を有する2分節型のウイルスの性状について、培養細胞における増殖曲線、通常のウイルスとの重感染の可能性、干渉作用の有無について検討する。また、Edmonston-tag株のP遺伝子を持つ2分節型のウイルスも作製して、非分節型のウイルスで認められた神経病原性の低下が2分節型のウイルスにおいても再現できるか否かをハムスターへの感染実験にて検討する。
次に、P遺伝子の変異とインターフェロン応答への影響について更に検討する。SSPE大阪1株および大阪2株のP遺伝子について、VおよびC蛋白の機能が保持されているか否かをハムスターへの感染実験およびin vitroのアッセイ系により、インターフェロンの応答について野生株およびワクチン株と比較解析する。
上記の実験と平行して、遺伝子欠損型の組換え麻疹ウイルスを作製するためのN、P、L蛋白発現細胞の作製を行う。レンチウイルスベクターを用いた方法により細胞へ導入し、発現を確認する。その後に欠損型の組換え麻疹ウイルスの作製を試みる。得られたウイルスを用いて、ハムスターへの感染実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
概ね当初の計画どおりに進行しているが、備蓄の試薬・消耗品の利用が可能で、組換えウイルスの作製および動物実験に要した経費が少額であった。
研究費は、組換えウイルスの作製および動物実験に使用する他、塩基配列の決定等のための消耗品に使用する。特に新たな高額備品は必要ではないが、実験に不可欠な基本的備品の老朽化に伴う買い換えや修理の必要が生じた場合には、機器の購入または修理費に当てる。また、これまでに達成された結果をまとめて論文にするため、論文の校正・投稿・掲載のための費用を予定している。
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