| 研究課題/領域番号 |
16K09996
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
石井 智弘 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70265867)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | STAR / Star / 先天性リポイド副腎過形成症 / ステロイドホルモン生合成 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、Star欠損ステロイドホルモン産生細胞株およびCre-loxPによる条件特異的Star欠損マウスを作成し、Steroidogenic acute regulatory protein（StAR）非依存性のコレステロール転送経路の制御機構、コレステロールエステル蓄積に伴う二次的障害の機序をin vitroおよびin vivoで解明することである。
1) Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成
マウスの副腎皮質腫瘍由来Y1細胞株にマウスStar遺伝子エクソン1を標的とする一対のtranscription activator-like effector nuclease (TALEN) 発現ベクターAをエレクトロポレーションで導入し、Star遺伝子の片アレルに5塩基欠失を持つY1細胞株を作成した。得られたStar片アレル5塩基欠失Y1細胞株に標的配列をずらしてデザインしたTALEN発現ベクターBをエレクトロポレーションで導入し、Starの対立遺伝子に1塩基欠失を持つY1細胞株（複合ヘテロ接合性変異）を作成した。得られた2クローンの細胞株について、ジブチル化cAMP刺激下でのStarのmRNA発現、蛋白発現ともに野生型Y1細胞株に比し有意に低下していることを確認し、今までに報告されていないStar欠損Y1細胞株が得られたことを証明した。
2）Star loxPホモ接合体マウス（Star floxedマウス）の作成
マウスStar遺伝子のエクソン7の翻訳領域をloxP配列で挟み、さらにFRT配列で挟んだneomycin耐性遺伝子（Neo）をloxP配列の間に挿入した相同組み換えベクターを作成した。この相同組み換えベクターをC57Bl/6N系統由来のマウスES細胞株へエレクトロポレーションで導入し、neomycinで選択した。PCR、サザンブロットでスクリーニングし、6クローンにおいて、Star遺伝子に相同組み換えを生じたES細胞株が得られたことを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成、Star loxPホモ接合体マウスの作成ともにほぼ計画通りに進行している。ただし、Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成に関しては、以下の2点において、研究計画を一部変更した。
1) ジフテリア毒素でオフターゲットをnegative selectionし、さらにpuromycin選択により一段階でStar両アレル変異Y1細胞株を作成する方法でなく、二組のtranscription activator-like effector nuclease (TALEN) 発現ベクターを用いて、二段階で複合へテロ接合性のStar両アレル変異Y1細胞株を作成する手法を採用した。
2) Star欠損株を作成する対象は、マウスの副腎皮質腫瘍由来Y1細胞株とマウスのLeydig細胞腫瘍由来MA10細胞株であったが、平成28年度にStar欠損株を得られたのはY1細胞株のみであった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成、Star loxPホモ接合体マウスの作成ともに、平成29-30年度の研究計画に沿って、以下のように推進していく予定である。
1) Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成
平成28年度の研究で得られたStar欠損Y1細胞株を中心に、その性質を評価していく。具体的には、ステロイドホルモン産生能、コレステロールエステル蓄積、トランスクリプトーム解析を予定している。
2) Star loxPホモ接合体マウス（Star floxedマウス）の作成
引き続き、相同組み替えES細胞株から、Star floxedマウスの作成を進めていく。Star floxedマウスが得られた際には、CAG-Creリコンビナーゼ/Ert1トランスジェニックマウスやCyp17a1-iCreリコンビナーゼトランスジェニックマウスと交配し、条件特異的Star欠損マウスの作成とその表現型解析を予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度の消耗品購入に充当する予定である
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