| 研究課題/領域番号 |
16K10019
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
赤羽 弘資 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (90377531)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | T-ALL / TYK2 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、T細胞型急性リンパ性白血病 （T-ALL）細胞の生存がJAK tyrosine kinase familyの一員であるTYK2に依存しているという知見をもとに、TYK2の阻害がT-ALL細胞において細胞死（アポトーシス）を誘導する機序を解明し、TYK2を標的とした治療を開発・発展させることを目的としている。私達は昨年度、米国Nimbus Therapeutics社のTYK2選択的阻害剤であるNDI-031301がヒトT-ALL細胞株においてアポトーシスを誘導し、その殺細胞効果にMAPKシグナル伝達経路であるERK、SAPK/JNKおよびp38 MAPKの活性化が関与している可能性を見出した。本年度の研究では、TYK2阻害で誘導されるアポトーシスのさらなる機序の解明を進めた。
最初に、NDI-031301で誘導されるMAPKシグナル伝達経路の変化とアポトーシスがoff-target効果でないことを確認するために、ヒトT-ALL細胞株のKOPT-K1を用いて干渉RNAによるTYK2のノックダウン実験を行った。その結果、TYK2をノックダウンした細胞では、NDI-031301添加後と同様に、SAPK/JNKおよびp38 MAPKのリン酸化レベルの上昇が確認され、アポトーシスも誘導されていた。次に、各々のMAPK経路の活性化がNDI-031301で誘導されるアポトーシスに直接に関与している可能性を検討した。NDI-031301添加で誘導されるKOPT-K1細胞のアポトーシスは、p38 MAPKの選択的阻害剤であるSB203580の共添加で部分的に抑制されたが、この抑制効果はMEK阻害剤やSAPK/JNK阻害剤の共添加では認められなかった。この結果から、NDI-031301で誘導されるT-ALL細胞のアポトーシスにはp38 MAPKの活性化が関与する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの解析で、私達はTYK2選択的阻害剤であるNDI-031301がヒトT-ALL細胞株においてその増殖を強力に抑制し、アポトーシスを誘導することを確認した。また、NDI-031301によるT-ALL細胞のアポトーシス誘導の機序として、STAT1リン酸化の抑制だけでなく、MAPKシグナル伝達経路であるp38 MAPKの活性化が関与している可能性を見出した。STAT1リン酸化の阻害はJAK選択的阻害剤であるtofacitinibとbaricitinibの添加後にも認められたが、これらの薬剤ではアポトーシスが誘導されなかったことから、NDI-031301で誘導されるT-ALL細胞のアポトーシスにはSTAT1リン酸化の阻害よりもp38 MAPKの活性化が重要な役割を果たしていると考えられる。一方、p38 MAPK経路の活性化はnegative selectionによる胸腺細胞のアポトーシス誘導にも関与することが報告されているため、TYK2は何らかの形でこの経路を抑制することによってT-ALL細胞だけでなく正常胸腺細胞の生存維持にも寄与している可能性が考えられる。T-ALL細胞においてTYK2阻害で誘導されるアポトーシスの分子生物学的機序を同定することは、同疾患に対してTYK2の標的療法を実用化するのに必須であり、得られた知見はより有効な薬剤併用療法を確立するための重要な情報になる。今後は、TYK2選択的阻害剤とT-ALLの臨床で用いられる各種抗がん剤との併用効果を確認する予定であり、p38 MAPKの活性化状態との関連性を検討することでTYK2選択的阻害剤を用いたより有効な薬剤併用療法の確立を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1） TYK2選択的阻害剤を用いた薬剤併用療法の開発
ヒトT-ALL細胞株におけるTYK2選択的阻害剤と各種抗がん剤との併用効果を、Isoborogram解析を用いて検討する。対象となる抗がん剤については、臨床的にT-ALL患者の治療で用いられているPSL、VCR、DNR、L-aspおよびNelarabine（Ara-G）を予定している。これまでの解析から、TYK2阻害で誘導されるT-ALL細胞のアポトーシスにはp38 MAPKの活性化が関与している可能性が示唆されているため、各種抗がん剤との併用がp38 MAPKのリン酸化に与える影響をウエスタンブロット法で解析して、治療効果との関連性を検討する。
（2） T-ALL細胞株におけるTYK2シグナルの薬剤感受性に対する影響の解析
TYK2シグナルがT-ALL細胞の化学療法抵抗性に関与している可能性を検討するために、野生型のTYK2を有するヒトT-ALL細胞株のJURKATとKOPT-K1に、ドキシサイクリン誘導型発現ベクターを用いて野生型もしくは活性型変異（E957D）を有するTYK2を遺伝子導入する。これらのクローンにおいて、ドキシサイクリンの添加による外来性TYK2の発現誘導を確認し、STAT1やMAPKシグナル伝達経路などの下流シグナルへの影響を解析する。次に、これらのクローンの各種抗がん剤（PSL、VCR、DNR、L-asp、Ara-G）に対する感受性をドキシサイクリン添加・未添加の間で比較し、TYK2シグナルの強化が各種抗がん剤感受性に与える影響について解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本解析の大部分は、研究室および実験機器センターの既存の設備で解析が可能であるため、実際には細胞株の維持や細胞株の分子生物学的解析・薬剤添加試験にかかる消耗品購入費用が研究経費の大部分を占めた。TYK2選択的阻害剤によるアポトーシス誘導の機序を解明するために生存シグナルに関連した蛋白の発現とリン酸化状態をWestern Blot法で解析したが、使用した複数の抗体はすでに施設が保有していたものを利用したため、当初予測したよりも少ない経費で解析することが可能であった。今後の研究における具体的な経費については、これまでの実験で使用した消耗品や抗体・各種試薬などにかかった費用をもとにして積算した。
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