ミトコンドリア選択的オートファジー障害による先天性溶血性貧血の病態解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K10041
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 菅野 仁 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (70221207)
• 研究分担者: 小原 洋志 東京大学, 医科学研究所, 特任講師 (40528733)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 先天性溶血性貧血 / iPS細胞 / 赤芽球分化 / オートファジー

研究実績の概要

全国の医療機関から依頼を受け、平成28年4月～平成29年3月までの1年間で73例の先天性溶血性貧血症例の検査を実施した。その結果、全体の約80%の症例に診断を確定出来た。
赤芽球分化過程におけるミトファジー関連遺伝子の発現変動を検討するため、iPS細胞を用いた分化誘導系を確立した。末梢血単核球より抗CD3抗体およびIL-2存在下で増幅したTリンパ球にセンダイウイルスを用いてリプログラミング4因子を導入した。得られたiPS細胞の品質評価のために、フローサイトメトリー解析および免疫蛍光染色により多能性マーカー発現に問題がないことを確認した。
iPS細胞の赤芽球への分化誘導は、次のように2段階の方法で行った。1）胚様体形成法によりCD34陽性未分化造血細胞を分化誘導した。2）分離したCD34陽性細胞をサイトカインの存在下でさらに培養し、CD235a陽性細胞を得た。CD235a陽性細胞の発現遺伝子をSurePrint 3G Human GEマイクロアレイ（アジレント社）で検出し、GeneSpring GX 14.5ソフトウェアを用いて解析した。
ミトファジー関連遺伝子10種（ULK1、BECN1、PIC3C3、AMBRA1、PRKAA1、ATG9A、TBC1D5、NIX、BNIP3L、FUNDC1）のうち、この分化誘導系で遺伝子発現を検出出来たのはAMBRA1、BNIP3L、FUNDC1およびTBC1D5の4種類であった。
以上より、原因未確定の先天性溶血性貧血症例に対する変異解析の対象とするミトファジー関連遺伝子は、上記4種類の遺伝子とすることに決定できた。今後、遺伝子変異スクリーニングで候補遺伝子変異を同定出来た場合、正常iPS細胞へのゲノム編集により患者遺伝子変異を導入し、確立した赤芽球への分化誘導系により、変異の意義を検討することが可能になると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

iPS細胞から赤芽球系への分化誘導系を確立し、遺伝子発現解析が可能になった。
現在先天性溶血性貧血関連67遺伝子のターゲットシークエンシング解析を実施しているが、H28年度の研究成果により、今後ミトファジー関連遺伝子4種を追加する方針を決定することが出来た。
成熟赤血球における残存ミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位差およびオートファジーマーカーLC3の解析に関しては、機器の老朽化による測定不良で条件検討が遅れている。

今後の研究の推進方策

先天性溶血性貧血の特殊検査受託例を更に増やすと同時に、原因未確定例を対象としたターゲットシークエンシングを開始する。
フローサイトメーターについては既にメンテナンスが終了している機器のため、早期に機種変更して、予定通りに研究を進めていく予定である。

次年度使用額が生じた理由

H28年度の研究計画にある先天性溶血性貧血症例の生化学的解析に用いる分光光度計が使用不可能となった為、急遽次年度分を前倒しして請求し、購入費用に充てた。

次年度使用額の使用計画

生化学的解析で、赤血球酵素異常症、膜異常症、ヘモグロビン異常症が否定された症例についてICを取得後、順次ミトファジー関連遺伝子のターゲット・リシークエンスを行う。

研究成果

• [雑誌論文] Exome sequencing identified RPS15A as a novel causative gene for Diamond-Blackfan anemia (2017)
  • 著者名/発表者名: Ikeda Fumika、Yoshida Kenichi、Okuno Yusuke、Shiraishi Yuichi、Tanaka Hiroko、Chiba Kenichi、Muramatsu Hideki、Kanno Hitoshi、Ohga Shouichi、Ohara Akira、Kojima Seiji、Kenmochi Naoya、Miyano Satoru、Ogawa Seishi、Ito Etsuro
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 102 ページ: e93-e96
  • DOI: 10.3324/Haematol.2016.153932
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Diagnostic challenge of Diamond-Blackfan anemia in mothers and children by whole-exome sequencing (2017)
  • 著者名/発表者名: Ichimura T, Yoshida K, Okuno Y, Yujiri T, Nagai K, Nishi M, Shiraishi Y, Ueno H, Toki T, Chiba K, Tanaka H, Muramatsu H, Hara T, Kanno H, Kojima S, Miyano S, Ito E, Ogawa S, Ohga S
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 105 ページ: 515-520
  • DOI: 101007/s12185-016-2151-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical Utility of next-generation sequencing for inherited bone marrow failure syndromes (2017)
  • 著者名/発表者名: Muramatsu H,Okuno Y,Yoshida K,Shiraishi Y,Diosaki S,Narita A,Sakaguchi H,Kawashima N,Wang X,Xu Y,Chiba K,Tanaka H,Hama A,Sanada M,Takahashi Y,Kanno H,Yamaguchi H,Ohga S,Manabe A,harigae H,Kunishima S,Ishii E,Kobayashi M,Koike K,Watanabe K,Ito E,Tanaka M,Yabe M,Ogawa S,Miyano S,Kojima S
  • 雑誌名: Genet Med 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1038/gim.2016.197
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Erythrocyte glutathione is a novel biomarker of Diamond-Blackfan anemia. (2016)
  • 著者名/発表者名: Utsugisawa T, Uchiyama T, Toki T,Ogura H, Aoki T, Hamaguchi I, Ishiguro A, Ohara A, Kojima S, Ohga S, Ito E, Kanno H.
  • 雑誌名: Blood Cells, Molecules and Diseases 巻: 59 ページ: 31-36
  • DOI: 10.1016/j.bcmd.2016.03.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] PIEZO1 gene mutation in a Japanese family with hereditary high phosphatidylcholine hemolytic anemia and hemochtomatosis-induced diabetes mellitus (2016)
  • 著者名/発表者名: Imashuku S,Muramatsu H,Sugihara T,Okuno Y,Wang X,Yoshida K,Kato A,Kato K,Tatsumi Y,Hattori A,Kita S,Oe K,Sueyoshi A,Usui T,Shiraishi Y,Chiba K,Tanaka H,Miyano S,Ogawa S,Kojima S,Kanno H
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 104 ページ: 125-129
  • DOI: 10.1007/s12185-016-1970-x
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] ALDH2 polymorphism in patients with Diamond-Blackfan anemia in Japan (2016)
  • 著者名/発表者名: Ikeda F,Toki T,Kanezaki R,Terui K,Yoshida K,Kanno H,Ohga S,Ohara A,Kojima S,Ogawa S,Ito E
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 103 ページ: 112-114
  • DOI: 10.1007/s12185-015-1891-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP11C is a major flippase in human erythrocytes and its defect causes congenital hemolytic anemia (2016)
  • 著者名/発表者名: Arashiki N, Takakuwa Y, Mohandas N, Hale J, Yoshida K, Ogura H, Utsugisawa T, Ohga S, Miyano S, Ogawa S, Kojima S, Kanno H
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 101 ページ: 559-565
  • DOI: 10.3324/haematol.2016
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Generation and Fanctional Analysis of Congenital Dyserythropoietic Anemia(CDA) Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Kohara, Hiromi Ogura, Takako Aoki, Chika Sakamoto, Yoshie Ogawa, Shohei Miyamoto, Hitoshi Kanno, Kenzaburo Tani
  • 学会等名: American Society of Hematology, 58th Annual Meeting ＆Exposition
  • 発表場所: San Diego（America)
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] The Novel missense Mutation of GATA1 Caused red Cell Adenosine Deaminase Overproduction Associated with Congenital Hemolytic Anemia (2016)
  • 著者名/発表者名: Taiju Utsugisawa, Hiromi Ogura,Toshiyuki Yamamoto,Takako Aoki,Takuya Iwasaki,Yumiko Ondo,Takahiro Kawakami, Shinichiro Nakagawa, Shuichi Ozono, Hiroko Inada, Hitoshi Kanno
  • 学会等名: American Society of Hematology, 58th Annual Meeting ＆Exposition
  • 発表場所: San Diego（America)
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] 先天性溶血性貧血の診断におけるターゲットシークエンシングの有用性 (2016)
  • 著者名/発表者名: 岩﨑 拓也、山本 俊至、村松 秀城、奥野友介、佐藤 裕子、三井 哲夫、小野田 正志、矢野 未央、小松 博史、坂本 謙一、青木 貴子、岡本 好雄、槍澤 大樹、小倉浩美、小島 勢二、菅野 仁
  • 学会等名: 第78回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • 年月日: 2016-10-14 – 2016-10-14
• [学会発表] Next generation sequencing in diagnosis of congenital hemolytic anemia. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kanno H, Utsugisawa T, Ogura H
  • 学会等名: The 5th TSH International Symposium, Red Cell Disorders.: From Bench to Bedside
  • 発表場所: Bangkok, Thailand
  • 年月日: 2016-05-21
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] HbA1cが偽性低値を示したエノラーゼ異常症の1例 (2016)
  • 著者名/発表者名: 井島 廣子, 古賀 正史, 中村 倫子, 松下 文美, 坂本 英美, 岩崎 剛, 松本 理恵, 陣内 冨男, 梶原 敬三, 稗島 州雄, 杉山 正悟, 小倉 浩美, 菅野 仁, 陣内 秀昭
  • 学会等名: 第59回日本糖尿病学会年次学術集会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都）
  • 年月日: 2016-05-20 – 2016-05-20
• [学会発表] Congenital hemolytic anemia due to red cell enzymopathies. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kanno H, Utsugisawa T, Ogura H
  • 学会等名: The 5th TSH International Symposium, Red Cell Disorders.: From Bench to Bedside
  • 発表場所: Bangkok, Thailand
  • 年月日: 2016-05-20
  • 国際学会 / 招待講演
• [図書] MedicalPractic 【貧血 実地医家に役立つ知識と診療の進めかた】 セミナー臨床に役立つ知識と情報 溶血性貧血の鑑別診断の進め方 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉浩美, 菅野 仁
  • 総ページ数: 166
  • 出版者: 文光堂
• [図書] 血液内科 【貧血性疾患診療の進歩】 先天性溶血性貧血の遺伝子診断 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大賀 正一, 山城 安啓, 菅野 仁
  • 総ページ数: 273
  • 出版者: 科学評論社
• [図書] 小児内科 【血球の増加と減少】赤血球 貧血 遺伝性貧血 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉浩美、菅野 仁
  • 総ページ数: 140
  • 出版者: 東京医学社
• [図書] 見過ごせないウイルス感染症ヒトパルボウイルスB19 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大賀 正一,猪股 裕紀洋,菅野 仁,田村 正徳,八重樫 伸生
  • 総ページ数: 180
  • 出版者: メディカルレビュー社