| 研究課題/領域番号 |
16K10042
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
永田 智 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (70266055)
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| 研究分担者 |
鶴田 敏久 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (70197771)
千葉 幸英 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80567991)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | heat-shock protein / プライマー / サンドイッチELISA / 16S rRNA遺伝子 / RT-qPCR / ポリクローナル抗体 / 咽頭拭い液 |
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| 研究実績の概要 |
川崎病の原因を確定するため、過去に申請者が患者の上部消化管から検出した「病原体の遺伝子」および川崎病の主要な合併症である冠動脈瘤形成の発端となる「病原体特異的なheat-shock protein(HSP) 」を川崎病患者の臨床検体から検出しうるツールの開発を試みた。
1. 病原体の遺伝子の分子生物学的検出法
今年度、Acinetobacter, A. radioresistens, Neisseria canis subgroup, N. annimalis subgroup, N. sicca subgroup, N. gonorrhoeae subgroup, N. flava subgroup, N. weaveri , N. subflava の特異的プライマーの開発に成功した。川崎病患者急性期血液検体31検体、咽頭拭い液検体19検体を用いて、これらのプライマーを用いてのRT-qPCRによる菌数定量解析を施行した。その結果、実際の川崎病患者上部消化管のみから検出された新種のNeisseria属の菌株の遺伝子が、咽頭拭い液検体19検体のうち11検体から検出されていた。なお、急性期血液検体からは、上述のいずれの菌遺伝子も認められなかった。
2. 病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体による定量
川崎病急性期血清のAcinetobacter HSP60（Acinetobacter 125-138）およびNeisseria HSP60 (Neisseria 419-432)のサンドイッチELISA（間接法）によるHSP60定量系の開発に成功した。この検討により得られたポリクローナル抗体を用いて、川崎病急性期血清31検体を解析したところ、1検体のみ高抗体価(640倍)のNeisseriaHSP60を検出するに至った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本来なら、疾患対照検体からの細菌遺伝子および細菌特異的HSP60タンパクの検出まで着手する予定であったが、新種のNeisseria株のプライマーおよびその産生物であるHSP60を検出する抗体の開発に時間がかかった。しかし、かなりの高精度のものを完成させることができたことから、次年度以降は、疾患対照検体を中心とした臨床検体の解析に集中できることが最も大きな意義、重要性と考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
過去に川崎病患者上部消化管のみから検出された新種のNeisseria属の菌株の遺伝子が、咽頭拭い液検体19検体のうち11検体から検出された可能性が示唆されたが、これが疾患対照検体から検出されないことを今後確認する必要がある。
さらに、病原体特異的HSP60タンパクの検出用のポリクローナル抗体を用いた川崎病急性期血清の解析では、31検体中1検体のみしか高抗体価のNeisseriaHSP60を検出されなかった理由として、血液検体採取時期が関与している可能性が考えられた。患者HSP60がこのHSP60と交差反応して冠動脈病変に関与すると考えれば、患者HSP60の採取時期を今後は回復期にずらすことを計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該助成金が生じた理由は、当該年度に予定していた策定会議が出席者の都合でキャンセルされたため、その分の交通費を消費しなかったためである。
翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画として、当該年度に開発した病原体の遺伝子を分子生物学的に検出するプライマーと病原体特異的HSP60タンパクの検出用の抗体を用いて、次年度に川崎病検体15例、疾患対照検体30例を目標に、臨床検体（血液検体、咽頭拭い液検体）の解析および成果報告および策定のための会議を予定している。
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