研究課題/領域番号 |
16K10053
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研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
研究代表者 |
二村 恭子 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 免疫アレルギー・感染研究部, (非)研究員 (60596956)
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研究分担者 |
五十嵐 ありさ 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 免疫アレルギー・感染研究部, (非)研究員 (60572998)
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研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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キーワード | ORMDL3 / 小児発症気管支喘息 / ウイルス感染 / 小胞体ストレス |
研究実績の概要 |
これまでに複数のゲノムワイド関連解析で小児期発症の気管支喘息に強い相関をもつ領域として第17 番染色体12-21 が同定され、疾患感受性遺伝子としてORMDL3分子に注目が集まっているが、小児の気道特異的に作用する機序は未だに明らかでない。本研究では、小胞体ストレス応答関連分子として同定されたORMDL3分子について、小児期に頻発するウイルス感染時におけるアレルギー性炎症に対する影響を様々な角度で検討し、気管支喘息発症のメカニズムの一端を解明することを目的としてする。 初年度はヒト小気道上皮細胞(SAEC)を用いたin vitroの実験系を用いて、培養系にdsRNAを添加したウイルス感染モデルにおける小胞体ストレスの一系路の関与を検討・確認した。また、同じモデルにおいて、既に予備検討で確認した小胞体ストレスを軽減するケミカルシャペロンによるサイトカイン産生の抑制効果を他の薬剤を添加した系でも同様に認め、小胞体ストレスの作用をウイルス感染時におけるアレルギー性炎症促進作用が示唆された。 また上記のin vitroの検討をin vivoでも実施すべく、研究の開始時点では市場で入手可能なノックアウトマウスが存在しなかったため、ormdl3ノックアウトマウスの作製を行った。その際は従来より効率的な手法としてCRISPR-Cas9システムを用いて得られた変異マウスを掛け合わせ、その後の継代により、ormdl3変異ホモマウスを作成した。樹立されたormdl3ノックアウトマウスにおける気道炎症の評価等により、生体内での機能についても解析を進めていくことが可能となった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ORMDL3のin vitroにおける機能解析として、ヒト下気道上皮細胞(SAEC)における培養系にdsRNAを添加したウイルス感染モデルにおいて、小胞体ストレスの一系路にある遺伝子の発現増強を検討・確認できた。また、同じモデルにおいて既に予備検討で確認した小胞体ストレスを軽減するケミカルシャペロンによるサイトカイン産生の抑制効果を他の薬剤を添加した系でも同様に認め、小胞体ストレスの作用をウイルス感染時におけるアレルギー性炎症促進作用が示唆された。 一方、in vinoでの検討を目的としたormdl3ノックアウトマウスの作製については、CRISPR-Cas9システムを用いて、1~18塩基の挿入または欠失を持つ11匹の変異マウスを得た。このうちフレームシフトによりアミノ酸配列が変化していると考えられる4塩基欠失マウスについて、ormdl3以外の遺伝子が変異していないか確認を行ったところも問題がなかったため、4塩基欠失マウス同士の掛け合わせ・継代によりhomoマウスを作製した。尚、このhomoマウスは、同腹から継代した野生型と比較し、4週齢での体重や表現型には差は見られなかった。
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今後の研究の推進方策 |
今後の予定としては、初年度で明らかとなったウイルス感染時に小胞体ストレス応答の経路について、ヒト下気道上皮細胞においてより詳細な検討を行い、気道炎症増悪に関与するサイトカイン産生誘導分子を追究する。 また、当初の予定通りであるヒト末梢血T細胞におけるウイルス感染時のORMDL3の機能解析についても検討を開始する。 さらに初年度に作製・樹立したormdl3ノックアウトマウスを用いて、ヒト気道上皮細胞やヒトT細胞で検討した事項を検証する。まず、dsRNA吸入により、気管支洗浄液ないしは血清中のTSLPをはじめとした誘導されるサイトカイン、ケモカイン産生量と発現プロファイルの変化をELISA法ないしマルチプレックスサイトカインアッセイで野生型と比較・検討を行う予定である。
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次年度使用額が生じた理由 |
実験手法を改良し、より小さなスケールで細胞培養を行うことが可能となったため、使用する培地や試薬量を節約することが出来たため。
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次年度使用額の使用計画 |
マルチプレックスサイトカインアッセイの測定項目アナライトを増加させたり、小胞体ストレス応答関連遺伝子のノックダウンに用いる新たなsiRNAの購入を予定している。
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