| 研究課題/領域番号 |
16K10074
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
前田 潤 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (00255506)
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| 研究分担者 |
内田 敬子 慶應義塾大学, 保健管理センター(日吉), 講師 (50286522)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 肺血管幹細胞 / 肺血管内皮前駆細胞 / Sca-1 / CD31 |
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| 研究実績の概要 |
幹細胞表面マーカーSca-1陽性かつ血管内皮細胞表面マーカーCD31陽性細胞が、肺血管幹細胞であるという仮説のもとにマウス成獣肺を用いて以下の研究を行った。
研究初年度では、胎生14.5日のマウス胎仔肺や生後2日のマウス幼若肺を用いてSca-1陽性・CD31陽性細胞を免疫組織化学染色により観察したが、安定した結果が得られなかったため、今年度は8週齢の成獣を用いて、Sca-1陽性・CD31陽性細胞の時間空間的発現様式、および蛍光ソーティング（FACS）により単離したSca-1+CD31+細胞を培養し、血管内皮細胞分化の指標である管腔形成,をイメージングソフトにより観察した。Sca-1陽性細胞は、肺胞壁および肺胞間の血管壁に発現していた。血管内皮細胞マーカーであるvWFは、Sca-1と一部共発現していた。FACSによりSca-1陽性・CD31陽性細胞は約20%、Sca-1陽性・CD31陰性細胞は約10%、Sca-1陰性・CD31陽性細胞は.約1%認められ、単離したSca-1陽性・CD31陽性細胞は培養後、樹枝状の管腔構造への分化が観察された。この分化は培養細胞数に比例して増加した。一方、Sca-1陰性・CD31陽性細胞の培養では、Sca-1陽性・CD31陽性細胞と比較して、同じ細胞数でも管腔形成が明らかに多く観察された。また、Sca-1陽性、CD31陰性細胞は培養により、培養皿に固着し、線維芽細胞様の外観を呈した。以上の所見から、Sca-1は肺血管幹細胞に発現している可能性があるが、マウス成獣では、むしろCD31陽性細胞、すなわち血管内皮細胞の血管新生を抑制する機能があると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マウス胎仔肺やマウス幼若肺において抗Sca-1抗体を用いた免疫組織化学染色の蛍光シグナルが安定せず、Sca-1発現の胎生期から生後早期の観察が困難で、胎仔、幼若肺組織からSca-1陽性細胞を単離することが困難であったことが最大の理由と考えられる。TSA-Plusキットを用いたcatalyzed reporter deposition法など、他の研究で実績のあるシグナル増幅システムを用いで染色を行ったが、明らかな改善を認めなかった。マウス成獣肺では安定した蛍光シグナルが得られたため、Sca-1は幹細胞マーカーではあるが、むしろ生後に発現が増加する蛋白質であるため、胎生期の肺における追跡が困難である可能性がある。また、当初Sca-1は肺血管への分化を促進すると考えていたが、培養実験ではむしろ分化を抑制する結果が得られたことも遅れの原因である。Sca-1の肺血管発生における機能が、成獣と胎仔で異なっている可能性が考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス成獣肺からのSca-1陽性・CD31陽性細胞、Sca-1陽性・CD31陰性細胞、Sca-1陰性・CD31陽性細胞の単離の効率を上げるために、種々の条件下でFACSを行い、至適条件を検討する。各々単離された細胞群の管腔形成能を複数回評価し、Sca-1が血管内皮細胞の分化、増殖を抑制するという一定の結果が得られるか確認する。培養実験で、Sca-1の肺血管新生に対する抑制能があると確認された場合、開胸し、液体窒素で一部肺組織を障害したマウスを用いて、Sca-1陽性・CD31陽性細胞、Sca-1陽性・CD31陰性細胞を各々肺組織へ注入し、生存率、肺組織障害の程度を比較し、Sca-1の肺血管新生に対する役割をin vivoで評価する。注入するSca-1陽性・CD31陽性細胞、Sca-1陽性・CD31陰性細胞は、GFP色素で全身組織が標識されたトランスジェニックマウスを用いる。
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