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2018 年度 実施状況報告書

川崎病におけるエクソソームmicroRNAの研究:新たな診断法、治療に向けて

研究課題

研究課題/領域番号 16K10079
研究機関日本医科大学

研究代表者

大橋 隆治  日本医科大学, 医学部, 准教授 (00328783)

研究分担者 深澤 隆治  日本医科大学, 医学部, 准教授 (80277566)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2020-03-31
キーワード川崎病 / 血管炎 / エクソソーム / マクロファージ / 免疫応答
研究実績の概要

本研究は、ヒト川崎病に類似した血管炎像を呈するCandia albicans water soluble-induced (CAWS) 血管炎モデルマウスモデル、およびヒト川崎病患者の血清や尿を使用し、川崎病血管炎発生における炎症、免疫応答、その過程でのエクソソームの役割を明らかにすることにより、ヒト川崎病の病態解明、および治療手段を確立することである。
①昨年度に引き続き、研究分担者の深澤が以前作製した、CAWS 血管炎モデルマウスモデルおよびコントロール群の心臓のパラフィン固定標本を各10匹づつ使用し、エクソソーム関連蛋白の同定を試みた。また、各種炎症細胞の動態について、形態学解析を施行した。さらに、エクソソーム、DNAの同定のため、in situ hybridization も施行した。
②マウス血清中のエクソソーム分画とそれ以外の分画からのmiRNAを試みた。10匹を1つの検体として、コントロール群と血管炎活動期からmiRNA抽出を行い、miRNA ready-to-use PCR mouse & rat panel I+II (Exiqon) を使用してReal time-PCR に基づくmiRNA の網羅的解析を試みた。
③昨年度からは、これらの動物実験に加えて、新たにヒト川崎病患者5名の冠動脈標本を入手し、組織学的、免疫動態の解析に関する実験も並行して開始した。特にmacrophage phenotypeを免疫染色にて同定することにより、川崎病における血管炎発症メカニズムの解明を試みた。対照群としては成人の動脈硬化標本を使用した。M1のマーカーとしては、CD86, SOCS3を、M2 のマーカーとしてはCD163, MRC1 を使用した。その結果、川崎病ではM1 phenotypeが、成人動脈硬化病変ではM2 phenotype が有意であることが判明した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

① CAWS 投与によりマウス血管炎を作成したが、個体ごとに血管炎の程度にばらつきがあり、CAWS 作成を繰り返す必要があった。
②昨年同様、マウス血管組織から、エクソソームを抽出し、その後の解析を試みたが、miRNAが微量であること、またmiRNAの変性が強く、再現性の高い結果が得られなかった。
③ヒト川崎病患者の冠動脈標本に対し、macrophage phenotype M1/M2の免疫染色を行うにあたり、複数の抗体を使用してpreliminary study を数回施行した。いずれの抗体も希釈倍率や前処理の条件が異なるため、適切な抗体、条件を確立するためにかなりの時間を要した。

今後の研究の推進方策

①追加でCAWS モデルマウスを作成し、組織、尿からmiRNA を抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。血清中のエクソソーム分画とそれ以外、心組織、尿を比較し、血管炎発症に関連するmiRNA を同定する。
②同定されたmiRNA について、CAWS モデルマウス惹起後の組織変化を評価する。
③ヒト川崎病患者の冠動脈標本におけるmacrophage phenotypeと免疫応答に関する免疫組織学的解析を、患者数をさらに増やして行う。

次年度使用額が生じた理由

理由:血管炎作成に手間取り、血清からのエクソソーム分画とそれ以外の分画からのmiRNAを十分、抽出することができなかったため、その後予定されていた実験が施行できなかった。
ヒト川崎病患者の冠動脈標本における免疫組織学的解析では、抗体の選別や条件設定に時間を費やしてしまいデータ解析の段階まで到達できなかった。
使用計画:新たなCAWSモデルマウスの作成、心臓、血清、尿検体を用いたより高品質なmiRNAの抽出。現在使用しているキットは、やや感度が劣るため、異なるメーカーの抽出キットも試す必要があると考える。また、ヒト川崎病患者の冠動脈標本におけるmacrophage phenotypeと免疫応答に関する免疫組織学的解析を、新たな抗体や手法を導入することにより、より規模を拡大して行う。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2018

すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] 中型血管炎 川崎病 川崎病の診断2018

    • 著者名/発表者名
      深澤隆治、小川俊一
    • 雑誌名

      日本臨床

      巻: 76 ページ: 183-189

  • [雑誌論文] Association of Severity of Coronary Artery Aneurysms in Patients With Kawasaki Disease and Risk of Later Coronary Events.2018

    • 著者名/発表者名
      Miura M, Fukazawa R et al
    • 雑誌名

      JAMA Pediatrics

      巻: 172 ページ: ):e180030

    • DOI

      10.1001/jamapediatrics.2018.0030.

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] Anti-inflammatory effects of adipose tissue-derived stem cell in a Kawasaki disease mouse model2018

    • 著者名/発表者名
      Uchimura R, Ueda T, Fukazawa R, Ohashi R et al
    • 学会等名
      14th Congress of Asian society for pediatric research
    • 国際学会
  • [学会発表] 川崎病血管炎モデルマウスに対する脂肪由来間葉系幹細胞投与の効果検証2018

    • 著者名/発表者名
      内村僚一、植田高広、深澤隆治、大橋隆治
    • 学会等名
      第121回 日本小児科学会総会

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公開日: 2019-12-27  

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