| 研究課題/領域番号 |
16K10111
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
中西 秀彦 北里大学, 医学部, 教授 (70528207)
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| 研究分担者 |
北原 秀治 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (40510235)
森川 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (70339000) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 微小血管障害 / 慢性肺疾患 / Angiopoietin-1 |
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| 研究実績の概要 |
本研究目標は、血管新生に重要な役割を果たしているAngiopoietin-1 (Ang-1)の投与が早産児慢性肺障害の改善に繋がると考え、Ang-1による高濃度酸素暴露後肺胞および肺胞微小血管障害への改善効果を解析することである。昨年度はリアルタイムPCRを用いて正常発達群（生後14日、21日）、高濃度酸素投与14日群、高濃度酸素暴露後ルームエア回復群の4群間におけるAng-1の遺伝子発現をみたところ、予想と反して高濃度酸素投与14日間投与後に2相性の変化を認める結果となった。そこで本年度は、Ang-1の詳細な遺伝子発現情報を確認するため、酸素暴露前、暴露後7日、10日、14日の時系列変化を検討した。
日齢0をコントロールとして、正常発達群におけるAng-1の発現は日齢7に平均（SD）0.70（0.10）と低下したが、日齢10：0.92（0.13）、日齢14：1.42（0.25）、日齢21：1.85（0.13）と日齢とともに発現の上昇を認めた。高濃度酸素肺障害モデルでは、暴露後7日：2.93（3.17）、暴露後10日：6.50（3.83）と、Ang-1の発現は予想に反して経時的に上昇しており、暴露後14日には0.98（0.09）と低下していた。一方、ルームエア回復群におけるAng-1発現は、13.1（9.44）と大きな上昇を認めた。
今回の結果から、高濃度酸素投与下では、Ang-1は蛋白発現レベルで抑制を受けている、もしくはターンオーバーが亢進している可能性があり、遺伝子レベルでの上昇はフィードバックによる影響と推測される。今後の実験計画としては、Ang-1のタンパクレベルでの肺組織における発現をウエスタンブロットや免疫組織染色により確認することと、Ang-1受容体レベル（Tie-1、Tie-2）での遺伝子発現の時間的推移を検討する必要があると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度末に、研究責任者の異動があったこともあり、やや予定よりも遅れて進行しているが、許容範囲内である。Ang-1の遺伝子発現が、高濃度酸素投与群で上昇傾向を認めたことは、仮説に反する結果であり、より詳細な発現情報を確認するため、ワンポイントだけでなく、暴露前、暴露後7日、10日、14日といった時間的推移を他の関連遺伝子でも確認する必要があること、蛋白レベルでの発現も確認する必要があると思われ、その追加実験が必要と考える。実験対象として新生仔マウスを用いているが、モデル肺を得るのに3週間の期間が必要であること、また母マウスのNursing Careも個体数獲得のために重要な要素であるため、技術面、実験動物飼育の環境面での改善も今後の検討課題である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．各群におけるAng-1-Tie2シグナルの生化学・分子生物学的手法による動向の解析： 29年度に引き続きAng-1の投与効果を立証する上で、高濃度酸素投与による障害および回復過程におけるAng-1-シグナルの動向を評価することが必要である。そこで、Ang-1-Tie2シグナルとVEGF-A、Flk-1、Flt-1の動向を引き続き遺伝子レベルで解析する。その際には、高濃度酸素暴露前、暴露後7日、10日、14日といった時間的推移も考慮して発現経過を検討する。またAng-1、Ang-2、Tie2のタンパク発現量を確認すること、シグナル蛋白であるPhospho-Aktに対する特異抗体を用いたウエスタンブロット法を用いて、各群におけるこれら発現を蛋白レベルでも明らかにする。高濃度酸素暴露およびその回復期におけるAng-1-Tie2シグナルとVEGF-A、Flk-1、Flt-1の発現に臓器特異性があるのか、肺のみならず、肝臓、腎臓、脾臓、心臓を用いて検討する。
２．Ang-1投与による高濃度酸素障害後の肺胞構造に対する効果の形態学的解析： 正常発達群、高濃度酸素投与群、高濃度酸素暴露後ルームエア回復群に加え、回復期再生モデルとして、Ang-1を酸素離脱直後（日齢14）と日齢17に腹腔内投与することにより作成する。各群の肺組織切片から均等にサンプリングを行い、客観的に肺胞数、肺胞面積、肺胞中隔数を評価する。また超微形態観察を、内皮細胞、基底膜、上皮細胞から構成される血液空気関門や、その他肺胞Ⅱ型上皮細胞なども合わせて、これらの細胞内微小器官の変化にも注目しながら解析し、肺胞壁に存在するどの細胞が障害を受けたのか、血管を構築する細胞間のネットワークがどのように変化を受けたのかを、細胞内小器官を含めた微細構造レベルで解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）次年度繰越金の発生に関しては、必要でなかったわけではなく、次年度における必要物品およびその他での使用の際に必要となることを想定したためである。
（使用計画）本研究では、電子顕微鏡を用いた微細構造レベルの解析が重要な位置を占める。また検索の過程においては、肺胞壁を構成する細胞群を明らかにするために、それらの可視化のための抗体をはじめとした試薬類が必須である。具体的な消耗品費としては、実験用動物（ ICRマウス他）の購入費および飼育費、試薬類には、培養用血清、免疫染色用の抗体、分子組織化学用の制限酵素、プローブ標識キット、標的遺伝子プライマー、PCR用試薬、電子顕微鏡用には、樹脂包埋キット、超薄用ダイヤモンドナイフ、画像解析用のコンピューター関連品、また、プラスティック器具類、論文別刷代などの諸費用が含まれる。その他、学外研究者との情報交換のための旅費、ならびに成果発表のための学会参加費などの旅費( 国内外を含む)、印刷費( カラー印刷)、論文投稿費用などが経費に含まれる。
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