| 研究課題/領域番号 |
16K10131
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
山口 由衣 横浜市立大学, 医学部, 講師 (60585264)
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| 研究分担者 |
相原 道子 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (90231753)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 単球 / マクロファージ / 乾癬 / カベオリン |
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| 研究実績の概要 |
乾癬患者において、臨床的に肥満は悪化因子となり、乾癬自体は動脈硬化を悪化させることが知られるが、乾癬病態と動脈硬化性炎症における直接的な炎症増悪メカニズムはまだ不明な点が多い。動脈硬化性炎症において重要な働きをする単球は、多くの乾癬関連サイトカインを産生するだけではなく、その多彩な形質から、組織に遊走、接着し、マクロファージ(Mq)へ分化することで直接的に組織炎症に関与する。一方、我々が着目するカベオリン1（Cav-1）は、細胞膜タンパクであり、脂質代謝を制御するほか、各種シグナル伝達因子に直接的に作用し抑制的に制御する。乾癬表皮細胞では、Cav-1発現が有意に低下しており、それがJAK-STAT系シグナルの増強、更なる表皮増殖、およびケモカインの産生を有意に増強させることをこれまで報告してきた。本研究では、乾癬における末梢血細胞、特に単球・マクロファージの病態への関与を、動脈硬化性炎症やカベオリン発現異常に着目して解析することを目的とした。まず、末梢血単球の活性化状態を評価するため、乾癬患者および健常人から末梢血単核球を採取し、CD14+CD16+炎症性単球、および、CD14＋CD69+の活性化単球の割合を検討したところ、ともに乾癬患者で有意に上昇しており、乾癬病態における単球の活性化が示唆された。さらに、乾癬患者の末梢血単核球におけるカベオリン発現異常が病態に影響する可能性を考え、末梢血におけるカベオリン発現を検討したところ、乾癬患者では健常人に比較して、末梢血単核球、特に分離した単球において有意にカベオリン発現が低下していた。そこで、末梢血単球のカベオリン発現をRNA干渉法で低下させ、LPS刺激によるサイトカイン産生を検討したところ、IL1などのサイトカイン産生が増強した。現在さらに機能解析を進めている。分離した単球におけるマクロファージ分化マーカー発現も検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度に予定していた、末梢血単球におけるM1M2マーカーの発現などの形質異常の解析はやや遅れているものの、次年度に予定していた、乾癬患者および健常人における末梢血免疫細胞のカベオリン発現の検討やその機能解析が予定以上に進行しており、全体としてはおおむね順調であると判断した。末梢血細胞は浮遊細胞であり、特定遺伝子の発現をRNA干渉法でノックダウンすることが難しく、その系の確立にやや時間がかかったが、現在問題なく施行できている。また、本研究は、患者末梢血を使用しており、特に免疫抑制剤や生物学的製剤などによって免疫修飾のかかっていない患者さんの血液を獲得する必要があるため、その進行にはやや不規則で時間がかかる。その対応策として、患者さんの血液検体の取得ができない期間に、他の実験系を進行させている。そのため、当初に予定した実験計画が年度をまたいで前後することがある。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のように、患者サンプルの獲得が必要な解析にはやや時間を要するが、これまでの進行状況を考えると、3年間の計画は期間内に完了できると考えている。今後は、さらなる患者サンプルの収集と、その検体を用いた複数の実験系を同時進行するために十分な体制を組んでいる。患者末梢血単球におけるM1M2マーカーを含めた形質異常の有無をまず明らかにし、さらには、培養系を用いたマクロファージ分化法を確立し、乾癬患者単球およびマクロファージにおける動脈硬化炎症への関与の検討を進める。現在マクロファージへの分化の系を確立できている。また、乾癬患者単球におけるカベオリン発現異常が及ぼす機能の解析、具体的にはサイトカイン産生のほか遊走能の解析などを継続し、乾癬病態への寄与を明らかにする。さらには、カベオリン発現低下単球がマクロファージへ分化した際に、乾癬病態および動脈硬化病態に関与するのか、マクロファージの形質や機能も検討する予定である。また、イミキモドによる乾癬様皮膚炎モデルマウスを用いて、カベオリン機能ドメインを含むペプチドを全身投与することによる皮膚炎の変化を検討する。肉眼的皮膚炎の評価のほか、病理学的検討、および皮膚浸潤細胞を皮膚より抽出し、サイトカインプロファイルやカベオリン発現も含めて解析し、カベオリン発現の修正が治療標的となり得るかを検討する予定である。これまでの経験により、イミキモドマウスの作成、およびカベオリン機能ペプチドを用いた実験は確立されている。現在、皮膚浸潤細胞の解析法を検討中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は主に患者さんより採取した末梢血を用いた解析が中心となり、比較的大きな費用を必要とするRNA干渉法や培養実験、マウスを用いた解析が少なかったため、次年度に研究費を残す結果となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度以降は、細胞培養や遺伝子操作の実験が増える事、またマウスを用いた実験も行うため、新たに購入すべき試薬が多くなる。具体的には、培養系実験の培地などのランニングコスト、サイトカイン測定のためのELISA試薬、RNA干渉法やマクロファージ分化実験における試薬、マウスの購入、維持などが比較的高額になってくる。
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