| 研究課題/領域番号 |
16K10139
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
安藤 祥司 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (20193104)
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| 研究分担者 |
本田 裕子 佐賀大学, 医学部, 教務職員 (60295053)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヘアケラチン / 中間径フィラメント / 貧毛症 / 蛍光蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
毛髪の形成機構と貧毛症の発症機序の解明に向けて、動物培養細胞にヒトのヘアケラチンK85および貧毛症のK85変異体をそれぞれ発現させ、K85の機能および遺伝子変異の影響を解明することが本研究の目的である。
K85は中間径フィラメント（IF）の一種で、K35とペアとなって毛皮質細胞の分化段階で最初に発現される。そこでまず、ヒトのK85とK35の遺伝子を、人工合成した（外注）。次に、両遺伝子を動物細胞内で発現するベクターに連結した。具体的には、K85をpAcGFP1-Hyg-N1に、K35をpDsRed-Monomer-N1に連結した。これによりK85とK35は、それぞれのC末端に緑色蛍光蛋白質AcGFP1と赤色蛍光蛋白質DsRedが融合された蛋白質として発現される。対照としてサイトケラチンK14とK5のcDNAを、pAcGFP1-Hyg-N1とpDsRed-Monomer-N1に連結した。動物細胞としてSW-13細胞とHaCaT細胞を用いた。SW-13細胞は内在性のサイトケラチンを発現しないが、少数の細胞がビメンチンを発現する。そこで遺伝子導入に先立って、内在性のビメンチンを発現する細胞（Vim +）と発現しない細胞（Vim -）を単離・クローニングした。
HaCaT細胞にK5-K14とK35-K85のペアをそれぞれ発現させると、細胞質全体に広がるIFを形成した。K5-K14とK35-K85は内在するサイトケラチンと共重合している可能性がある。現在、SW-13細胞（Vim -）と（Vim +）におけるK5-K14とK35-K85の発現を解析中である。これまでの所、細胞質にIFを形成する細胞と、短い繊維状やドット状のものを形成する細胞が見られた。今後は、他の種類の動物細胞についても同様の解析を進めるとともに、IFや短い繊維状構造物の詳細な解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．目的蛋白質であるヒトのヘアケラチンK85とK35、対照となるサイトケラチンK14とK5を、それぞれ緑色あるいは赤色蛍光蛋白質と融合させて動物細胞内で発現させるための系を計画通り構築できた。
２．解析に用いる動物細胞のSW-13細胞から、内在性のビメンチンを発現する細胞（Vim +）と発現しない細胞（Vim -）をそれぞれ単離・クローニングした。
３．動物細胞内で発現させたヘアケラチンあるいはサイトケラチンがつくる中間径フィラメントなどの重合産物の細胞内局在を、緑色および赤色の蛍光を使って解析する方法を確立できた。
４．HaCaT細胞を用いた解析から、K35-K85とK5-K14のペアはそれぞれ、内在するサイトケラチンと共重合して中間径フィラメントを形成する可能性が示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの所、K35とK85は内在性サイトケラチンの有無に依存して、細胞質に中間径フィラメントを形成する場合と、核の周囲に短い繊維状の構造物などを形成する場合が見られた。そこで今後は、内在性サイトケラチンの種類や発現量がHaCaT細胞やSW-13細胞とは異なる他の種類の動物細胞を購入し、同様の解析を行う予定である。それによってヘアケラチンの特性を明らかにしたい。また、貧毛症の変異をもつK85を動物細胞内で発現させて、野生型K85との機能性の違いを明らかにする。並行して、K35とK85が形成する中間径フィラメントや繊維状構造物の詳細な解析を行う予定である。
一方、ヘアケラチンの動物細胞における発現量の高低が、中間径フィラメントの形状に影響する可能性も考えられる。そこでヘアケラチンの発現量を現在の系よりも高くするために、他の発現プラスミドを購入し、それに乗り換えることも検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
主な理由として、人工遺伝子の合成価格が近年かなり低下したことや、動物細胞発現用プラスミドおよびHaCaT細胞を既に手元に所有していたことなどがあげられる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度は繰り越された研究費を使って、内在性サイトケラチンの種類や発現量がHaCaT細胞とは異なる他の動物細胞を購入する予定である。同時に、培地や血清などが大量に必要となるため、その購入にあてる。また、動物細胞におけるヘアケラチンの発現量を現在の系よりも高くするために、他の発現プラスミドを購入し、それに乗り換えることも検討したい。
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