研究課題
カルシウムイオン(Ca2+)は、細胞内情報伝達物質の１つで、神経伝達物質やホルモンの放出、細胞電位の調節、転写、細胞の分化や増殖、小胞の輸送、発汗、痛み調節など種々の作用を有している。この細胞内Ca2+濃度調節に関与するCa2+チャネルが、てんかん、自閉症、認知障害、発達障害などの精神神経症状や、発汗や痛みの病態に関与し、しかもこれらの症状がマンマリアンターゲットオブラパマイシン(mTOR)により調節されていることが報告された。そこで、TSC1,TSC2遺伝子の異常の結果、mTORC1の恒常的活性でおこる結節性硬化症(TSC)の、てんかん、自閉症、認知障害、発汗、疼痛などの症状は、いずれもイノシトール３リン酸(IP3)受容体を介したCa2+チャネルという共通の機構の異常でおこるのではないかと考え、この共通の機序を解明することにより、認知症、癲癇や発汗、疼痛の新規機序の解明を目指そうと考えた。本年度はまず、正常コントロールマウスと自閉症を呈するTSCのモデルマウスを用いて非刺激状態と熱による疼痛刺激、アセチルコリンによる発汗刺激時のマウスの脳の活性状態をマウスのMRIを用いて比較検討した。更に、これらの反応がmTORC1の阻害剤であるシロリムス投与で変化するかを検討した。さらに、Si-TSC1,TSC2ノックダウン神経細胞やアストロサイト、線維芽細胞を用いて細胞レベルでの刺激時及びラパマイシン投与時のCa2+の流入の比較検討を行った。その結果TSC モデルマウス、TSCモデル神経細胞では正常に比して活性化（Ca2+の流入）がおこっており、それらの異常はラパマイシン投与により改善される事が確認できた。
3: やや遅れている
汗腺の細胞の分離培養が困難で、更に汗腺の細胞にSi-TSC1,TSC2を導入して効率よくノックダウンを行うのも困難であった。現在汗腺そのものの組織培養を用いて検討する技術を確立中である。又TSCノモデルマウスの継続的な確保が困難で実験予定日に必要な週令のマウスをそろえるのに時間を様した。
2017年度は前述のマウスの脳、末梢組織の組織切片を用いて、IP3,IP3受容体、pmTORC1,Aktなど関連抗体で染色し、免疫組織化学的に、刺激時、シロリムス投与時の変化を比較検討する。同時にかCa2+の流入を調べた細胞を用いて、細胞レベルでも同様の染色を行いその変化を確認すると同時に、ウエスタンブロッティングやPCRでもそれぞれの蛋白の発現を確認する。前年度、汗腺細胞の培養が困難であったため、培養汗腺で刺激時の発汗やCa2+の流入の変化を２光子蛍光顕微鏡を用いて検討する。更にそれらを固定して免疫組織科学的に違いを検討し原因究明に向ける。
汗腺細胞の効率の良いノックダウンや培養ができず、また、モデルマウスの確保匹数（出産匹数）が少なかったために実験が遅れ、その為に購入予定であったマウスや抗体の導入が遅れ次年度に使用予定となった為次年度持ち越し額がふえた。別の試験で使用したマウスの再利用が可能であったため、新規の購入が控えられた為に経費が少し節約できた。
昨年中に終了する予定であった、マウスの脳組織や、細胞を用いた免疫組織科学的な検討は今年度に行う予定である。また、汗腺細胞の効率の良いノックダウンや培養ができずに実験が進まなかった、汗腺細胞における発汗の増加やカルシウム流入の検討などは、汗腺の培養細胞に変わる方法として昨年度検討し、ほぼ確立できた、培養汗腺細胞ではなく汗腺組織培養システムを用いて今年度に検討を行って行く予定である。
すべて 2017 2016
すべて 雑誌論文 (8件) (うち国際共著 7件、 査読あり 8件、 オープンアクセス 7件、 謝辞記載あり 4件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 6件)
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