| 研究課題/領域番号 |
16K10178
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
藤田 英樹 日本大学, 医学部, 准教授 (10323544)
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| 研究分担者 |
照井 正 日本大学, 医学部, 教授 (30172109)
葉山 惟大 日本大学, 医学部, 助教 (40647187)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 腸内細菌叢 / 乾癬 / アトピー性皮膚炎 / 蕁麻疹 |
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| 研究実績の概要 |
平成28年度は乾癬・アトピー性皮膚炎・慢性蕁麻疹の患者からの糞便の採取、および採取した糞便からの細菌叢DNAの精製と糞便中有機酸・遊離胆汁酸の分析を主に行う予定であったが、研究で糞便を扱う際の実験環境上の問題が生じたため、研究計画の見直しを行った。新たに、日本大学医学部病態病理学系微生物学分野および日本大学生物資源学部応用生物科学科との共同研究の形をとることにした。採取した糞便からの細菌叢DNAの精製を日本大学医学部病態病理学系微生物学分野と共同で行い、次世代シークエンサーを用いた細菌16SリボゾームRNA（16SrRNA）遺伝子のアンプリコン解析またはショットガン解析を日本大学生物資源学部応用生物科学科と共同で行うこととした。日本大学生物資源学部応用生物科学科においては共同研究を行う上で必要な同学部内での倫理審査等を進めている状態である。また、当初は外来患者については自宅にて採便をしていただき、宅急便で日本大学医学部皮膚科学分野へ郵送していただく予定であったが、不適切な点があることが判明したため、採取した糞便は外来受診時に患者に触接持参していただく方法に変更した。腸内フローラを解析する場合、採取した糞便の細菌叢を長期間、安定的に維持する必要があるため、細菌叢を室温（1～30℃）で長期間、安定的に維持でき、簡便に取り扱える採便容器のキットをすでにテクノスルガ社から購入しており、健常人5人からの糞便の採取を始めたところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度は研究に糞便を扱う上で実験環境上の問題が生じたため、研究に遅れが生じた。当初の研究計画では平成28年度は乾癬・アトピー性皮膚炎・慢性蕁麻疹の患者からの糞便の採取、および採取した糞便からの細菌叢DNAの精製と糞便中有機酸・遊離胆汁酸の分析を主に行う予定であったものの、健常人5人からの糞便の採取を始めたところにとどまった。しかし、日本大学医学部病態病理学系微生物学分野および日本大学生物資源学部応用生物科学科と共同研究を行うことで実験環境上の問題は解決されつつあり、糞便サンプルの収集も始めたところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は当初の研究計画に基づいて、乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹の患者からテクノスルガ社の採便容器のキットをを用いて糞便の採取を採取し、採取した糞便からQIAmp DNA Stool kit (QIAGEN社) を用いて細菌叢DNAの精製をすすめる。その後、KAPA Library Amplification Kit (KAPABIOSYSTEMS社)を用いて精製したDNAから16SrRNA遺伝子のV3とV4領域を含むプライマーによりPolymerase Chain Reaction (PCR)で460 bpの断片を増幅する。さらに、Nextera XT index kit (illumina社)を使用して タグ付加のみを目的とした8 cycleの PCR増幅でシーケンスに必要なアダプター配列の付加を行った後、次世代シークエンサーを用いて細菌16SリボゾームRNA（16SrRNA）遺伝子のアンプリコン解析またはショットガン解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は糞便を扱う上で実験環境上の問題が生じたため、研究に遅れが生じた。その遅れに伴い研究に必要な試薬等の購入を延期したため、当初想定していたよりも、使用額が少なくなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度は、当初平成28年度に割り当てて予定していた研究を遂行するとともに、可能な限り、次世代シークエンサーを用いた細菌16SリボゾームRNA（16SrRNA）遺伝子のアンプリコン解析またはショットガン解析を行う予定であるため、その分のテクノスルガ社の採便容器のキット、QIAmp DNA Stool kit (QIAGEN社)、Nextera XT index kit (illumina社)の購入を行う予定である。その分の試薬の購入を行う予定である。
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