| 研究課題/領域番号 |
16K10228
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
黒川 真奈絵 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 教授 (90301598)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | レビー小体型認知症 / 血清ペプチド / バイオマーカー / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
レビー小体型認知症(DLB)の診断に有用な血清ペプチドマーカー確立のため、DLB/nonDLB-4Pモデル(Int J Geriatr Psychiatry 2015;30:1195)を構成するペプチドのうち、2898、4052、4090 m/zのペプチドのイオン強度を、各々内部標準(IC)ペプチドを用い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF/MS)で定量する系を確立した。ICペプチドは、各々の目的ペプチドと同じアミノ酸配列を、一部のアミノ酸に安定同位体を標識して合成し、目的ペプチドより8-11 m/z大きく検出されるよう設定した。
個々のペプチド測定系において、目的ペプチドを含まない健常者血清4例の混合物に、目的ペプチドを2.5、5、10、20、40 pmol/μLになるよう混合した。ICペプチドは、この5検体全てに20 pmol/μL混合した。これらの混合検体より弱陽イオン交換(WCX)でペプチドを抽出し、MALDI-TOF/MS により検出したICペプチドイオン強度に対する目的ペプチドイオン強度の比率を計算し検量線を作成した。その結果、2898 m/zペプチドのイオン強度比率は0-40 pmol/μLの範囲でy=0.0452x+0.1323 (R2=0.9849)、同様に4052 m/zペプチドは0-40 pmol/μLの範囲でy=0.0376x+0.1048 (R2=0.9893)、4090 m/zペプチドは2.5-20 pmol/μLの範囲でy=0.0766x+0.7789 (R2=0.9672)の直線として表された。これらの3ペプチドについて、MALDI-TOF/MS による定量法を確立出来た。4090 m/zペプチドについては2.5-20 pmol/μLの範囲となるよう血清を希釈して測定することで、定量が可能であると考えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上記に記載した通り、DLB/nonDLB-4Pモデルを構成する2898 m/z、4052 m/z、4090 m/zのペプチドイオン強度を、安定同位体標識ICペプチドに対する比率としてMALDI-TOF/MSにより定量する系を確立した。DLB/nonDLB-4Pモデルおよび2Pモデルを構成する1737 m/zのペプチドは、健常人で高頻度に検出され、DLB患者より健常人で高い血清イオン強度を示す。そのため測定のバックグラウンドの設定に工夫が必要であったが、現在測定系をほぼ確立し確認を進めている。また、5002 m/zのペプチドは質量電荷比が大きいため同定が難しく、抽出カラムの種類を変更する等方法を改変しながら、現在同定中である。
DLBを含めた多数の臨床検体（血清）を用い上記で確立した方法で定量を行うため、申請者の所属機関で、新たに残血清を含めた末梢血検体を採取出来る臨床試験を申請し承認を得た。主たる疾患としてDLB、アルツハイマー型認知症 (AD)、パーキンソン病 (PD)等の症例を各群100-200例収集する目標のため、多施設で臨床試験の申請準備を進めており、その作業に時間を要している。その他の老年性認知症、老年性認知症以外の高齢者の精神疾患、軽度認知障害 (MCI) 等の症例も100例以上収集出来るよう、各病院の神経精神科及び神経内科と協同し準備を進めている。
また血清ペプチドが神経細胞に及ぼす機能を検討するため、高分化型神経芽腫の細胞株GIMENの培養系に各ペプチドを添加し、発現する蛋白質の変化を解析する予定としている。既に基本的なペプチド添加実験の条件を確認しており、今後解析法を検討する予定である。
以上のように、バイオマーカーとなるモデルを構成する個々の血清ペプチドの定量系を構築しながら、多施設共同臨床試験を進め、ペプチドの機能解析実験の準備を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
DLB/nonDLB-4Pおよび2Pモデルを構成する1737 m/z、5002 m/zのペプチドについて、まず5002 m/zのペプチドをLC-MSで同定する。5002 m/zペプチドはWCXでの抽出の後にMALDI-TOF/MS で検出されたものであるが、当該ペプチドのイオン強度が高いDLB患者血清を用いてもC18カラム処理では検出されなかったため、異なる交換体を用いて検出・同定を試みる。また1737 m/zペプチドのMALDI-TOF/MS定量系について、再現性を確認し、直線性を検証する。
申請者の所属機関では、各診療科における血清収集の具体的方法を速やかに確認し、出来る限り早期に被験者の同意のもとで収集を開始する。他の施設においても速やかに臨床試験を申請し、具体的な実施法をmini-mental state examination (MMSE) の取得も含め、協議し確立する。DLB、AD、PD、老年性認知症、認知症以外の老年性精神疾患、MCIおよび健常人が各々100例程度収集出来た段階で各ペプチドの定量を開始し、順次血清を収集しながら測定を進める。DLB/nonDLB-4Pおよび2PモデルのDLBバイオマーカーとしての有用性は、全ての測定が終了した後に評価する。
DLB/nonDLB-4Pおよび2Pモデルを構成するペプチドについて、親蛋白質から切断されて新たに獲得する機能の有無について検討する。具体的には、これらのペプチドをGIMENまたは海馬由来のヒト神経初代培養細胞等の培養系に添加し、細胞が発現する蛋白質のプロファイルに生じる変化を解析する。また、これらペプチドを親蛋白質から切断する酵素について同定を試みる。これらの結果よりDLBの病態に関わると考えられる機序が検出されれば、治療標的としての観点から、対象となる蛋白質の発現量や機能の調整を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
5002 m/zペプチドの同定が遅れていることが、主な理由である。当該ペプチドは、DLB/nonDLB-4Pおよび2Pモデルを構成するペプチドの中で分子量が最も大きく、従って合成にかかる費用が、5002 m/zペプチド自体およびその安定同位体標識ICペプチドのとも高額になる予定である。またアミノ酸配列が長くなることで合成が難しくなり、その分収量も少なくなるため、他のペプチドに比較しさらに費用がかかることが予想されているが、この分が使用出来ていない。5002 m/zペプチドが同定され次第、速やかに合成を開始する予定である。
5002 m/zペプチドの同定およびMALDI-TOF/MSによる測定系確立の後、全ペプチドを定量する予定であるので、その測定費が今後生じる。全ペプチドについて、収集した血清を同時期に測定する予定であり、その際に弱陽イオン交換体ビーズやMS測定試薬等が大量に必要となるため、使用期限を考慮してこれらを購入し、実験を遂行していく。
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